2014年6月16日
基于活细胞的检测在微板中越来越受欢迎。虽然钙通量测定在相当长一段时间内一直是g蛋白偶联受体测定的标志，但最近高含量的活细胞表型分析正用于药物发现。与均相分析一样，细胞基础分析的一个子集需要使用已集成到microplate阅读器的试剂分配器。有许多理由使用自动阅读器分配器结合细胞为基础的微板阅读。
在一些动力学分析中，反应的快速性要求在加入临界试剂和测定结果之间有精确的时间间隔。只有对试剂添加进行适当的读取器控制，才能在足够高的公差下评估时间，以确保所有井处理相同。例如，钙通量反应通常发生在几秒钟的过程中，这将排除手动添加试剂。
方便是使用自动试剂分配器的另一个原因。在很长一段时间内定期添加试剂，如果手动添加很费力，可以通过集成的试剂分配器实现自动化。这节省了时间和精力，同时提供了更一致的结果。
许多microplate阅读器有温度和CO2和/或O2气体控制，从读取器上取下极板会使电池暴露在环境温度和大气气体浓度下。使用集成分配器还可以避免电池暴露于环境变化，如温度或气体浓度。图1所示。
图1所示。直点胶机喷嘴的流体流动示意图。笔直的尖端提供了最好的试剂混合，以潜在的取代粘附细胞为代价。
当使用试剂分配器时，为了获得最一致的结果，关键是要快速混合添加的试剂到微孔板内现有的液体。体积、速率和尖端位置是有关混合的三个重要参数。相对于井中已经存在的流体量，正在分配的试剂体积可能是影响最大的参数。当试剂添加到总体积中(现有液+添加液)的比例更大时，混合会更有效。例如，在200 μL溶液中加入100 μL (3mm)溶液比在295 μL溶液中加入5 μL (60mm)溶液更有效地混合，即使试剂的最终浓度相同(1mm)。毫不奇怪，液体添加的速度也会影响混合效率，更快的液体速度比慢的速度混合更有效。试剂尖端的定位也可以发挥作用。流体进入井内的角度和喷嘴相对于井心的位置都是重要的参数。中心分配尖端在井和垂直方向提供了最好的混合剖面。
不幸的是，直针尖提供的高效率混合可能对细胞分析有害。注入井中的液体的力量和体积可能足以取代粘附在组织培养处理过的微板上的细胞。这是显微镜应用的特别关注，因为细胞将不再驻留在焦平面上，因此不会被成像。图2展示了这一现象的一个很好的例子，NIH3T3成纤维细胞单层受到试剂分配的显著影响。
图2。直点液头设计对细胞单层的影响。384孔板中表达GFP的NIH3T3细胞单层，用直滴针尖进行液滴(25 μL PBS)。用Cytation 3在给药前后对孔进行4X成像。
在这个例子中，分配的流体流动的力量足以克服已经存在于井中的流体的阻尼作用，并冲刷微微板底部的细胞，就像快速流动的溪流会移动河床上的岩石一样。已经存在于井中的液体通常作为缓冲液来减缓分配液的速度，但井液太少或试剂太多会超过井的减震能力。虽然可以改变添加液体的体积或分配率，以避免单层损伤，但最简单的解决方案是使用基于活细胞的测定的角度提示，需要在读取器内添加试剂。
通过横向流动，流体不再直接向下流向细胞单层，而是通过顶部的流体(图3)。这提供了有效的试剂混合，而不置换粘附的细胞。
图3。倾斜点胶器尖端的流体流动示意图。倾斜的针尖可以将液体输送到井的一侧，从而分散部分流体力，使细胞保持粘附。
BioTek为Synergy H1、Synergy Neo和Cytation 3开发了一种新的分配器顶端选项，用于将试剂分配到活细胞中(图4)。标准的分配器头使用不锈钢管安装到一个组件中，方便“无工具”安装和从读取器上拆卸。新的可选分配器头(P/N 1320514)使用不锈钢管，已在相同的快速更换组件角度20°。此外，点胶器头是偏移的，这样，有角度的尖端两端定位在井上方与标准点胶器头尖端相同的位置。这一特性使终端用户可以交替使用分配器磁头，而不必担心定位或更改板数据文件。
图4．的角度提示设计。20°角的分液器尖端允许液体分发而不置换粘附细胞。多变的设计允许在角度和直线尖端之间切换，这与均匀的测定工作最好。
图5。斜角点胶器尖端设计对细胞单层膜的影响。384孔板中表达GFP的NIH3T3细胞单层细胞，用20°角度的液点(25 μL PBS)进行液体分配。用Cytation 3在给药前后对孔进行4X成像。
图5展示了新设计的有效性。表达GFP的NIH3T3细胞在384孔板中生长并置于25 μL液液中。同一孔在试剂加入前后的代表性图像显示，细胞单层几乎没有损伤。角度点胶器尖端的一个实用例子是它们在监测钙通量与GPCR激活。加载FluoForté染料(Enzo Biochem)的CHO细胞在组胺的刺激下，由于钙通量的增加，荧光迅速增加(图6)。已知配体诱导的g蛋白偶联受体(GPCR)的激活会导致细胞内钙离子水平的增加。随着游离钙离子水平的增加，它们与钙敏感染料的相互作用导致荧光强度增加。钙的快速变化要求读者分配器尖端被用来增加刺激。
图6。GPCR激活诱导钙通量。负载FluoForté的CHO细胞在1 μM组胺刺激前后的20x图像和荧光图像。刺激后的时间以秒为单位显示在每张图像中。
如前所述，当涉及试剂添加时，不是所有的测定方法都是相同的。在试剂体积、浓度和分配率等方面总是要做出妥协，以实现优化。在均质分析中，关键元素通常是充分混合，而不溢出或溢出液体在读取器内。基于活细胞的测定有一个额外的复杂性层，因为粘附的细胞需要在充分的液体混合的背景下保持。角度分配尖端是另一个可以用于分析优化的工具。