2009年1月16日
作者:Paul Held，博士，安捷伦科技公司
半自动三聚氰胺定量
摘要
三聚氰胺是一种富含氮的化合物，通常用作阻燃剂，或与甲醛结合生产三聚氰胺树脂，这是一种耐用的热固性塑料，用于制造台面、织物和胶水。然而，除了三聚氰胺的正常使用外，还有几起非法使用该材料的报道。本应用笔记描述了安捷伦BioTek的使用2022世界杯附加赛决赛EL406结合安捷伦BioTek BioStack和安捷伦BioTek液体处理控制(LHC)软件，实现三聚氰2022世界杯附加赛决赛胺酶联免疫吸附试验的半自动化。
简介
三聚氰胺是一种富含氮的化合物，因被非法用作模仿食品中蛋白质的添加剂而声名狼藉。在许多国家，使用三聚氰胺废料作为动物饲料和食品添加剂，以增加蛋白质含量的做法很普遍。乐鱼平台入口这是因为三种胺基的存在，已知它们会与许多常用的蛋白质检测中使用的二脲试剂发生反应(图1)。最近，中国发生了一起丑闻，涉及二十多家公司和许多个人在牛奶和婴儿配方奶粉中添加三聚氰胺，导致肾结石和肾衰竭，导致数名婴儿死亡，5.3万多人患病。据美国食品和药物管理局报道，在美国的一些婴儿配方奶粉中也发现了微量的三聚氰胺。乐鱼平台入口
三聚氰胺检测是一种竞争性ELISA，其中三聚氰胺- hrp偶联物竞争与附着在微板孔上的三聚氰胺抗体结合。结合反应完成后，通过洗涤去除未结合的样品和共轭物。立即加入基材试剂，使颜色显现出来。通过加入停止溶液终止显色反应，并测定各孔的吸光度。然后，通过运行已知三聚氰胺浓度标准生成的标准曲线插值确定未知浓度。为了便于比较多个实验，数据被表示为与零标准的比率。这个比率通常用B/Bo表示。
材料与方法
三聚氰胺检测使用的是Abraxis (Warminster, PA)的ELISA试剂盒，按照试剂盒说明进行。离线制备样品和标准品，各100µL手动移液到检测板中。将平板装入安捷伦BioTek BioStack存储堆中，2022世界杯附加赛决赛开始试验。板依次自动转移到Agilent BioTek EL406，使用蠕动泵分配器添加50µL的分析共轭物。2022世界杯附加赛决赛然后，这些培养皿被放回生物堆栈，重新堆叠以恢复它们原来的顺序，并在室温下完成30分钟的孵育。孵育后，板再次自动转移到EL406，用300µL的洗涤缓冲液洗涤4次，然后使用其中一个注射泵分配器添加100µL的底物溶液。盘子自动返回到BioStack并重新堆叠。继续显色20分钟。显色后，印版自动返回到EL406。使用第二个注射器-泵分配器添加100µL的停止液，板返回BioStack。 After restacking, the absorbance of each well at 450 nm was determined using an Agilent BioTek Synergy 4 multimode microplate reader.
图2。三聚氰胺ELISA反应的步骤示意图。由安捷伦BioTek EL406清洗机进行的过程显示为红色2022世界杯附加赛决赛。
该过程使用LHC PC软件来控制培养皿的移动、处理和孵育步骤(图3)。孵育步骤在BioStack中进行，而培养皿处理，如清洗步骤、摇动和试剂添加使用EL406完成。编写了一个单独的LHC程序文件，以执行向板中添加样品到读取板的所有工艺步骤。板移动到EL406进行液体处理步骤，如清洗步骤，以去除未结合的材料或添加试剂(如共轭物，基质和停止溶液)。孵育步骤是使用生物堆栈作为储存培养皿的手段进行的。计算延迟时间，以便考虑到处理时间和重新堆叠过程(图3)。
结果与讨论
图4中的数据展示了使用EL406自动化三聚氰胺ELISA的流体处理任务的有效性。使用垫圈功能除去未绑定的材料，同时使用仪器的三个分配器添加必要的试剂。使用B/Bo计算，其中每个标准与零标准的比值，可以观察到信号的显著变化作为三聚氰胺浓度的函数。
利用数据的5参数逻辑拟合，可以通过曲线插值确定未知样本浓度。用零标准的平均值减去3倍其标准差的标准曲线插值计算出的检测限，在三次不同的实验中范围为10 ~ 30 ng/mL。
这里展示的数据证明了安捷伦BioTek EL406能够自动运行Abraxis的三聚氰胺ELISA试剂盒所需的液2022世界杯附加赛决赛体处理任务。结果数据与工具包插入作为示例数据提供的数据相当。EL406可以提供与四种不同仪器(1个清洗机和3个分配器)相同的功能。与安捷伦BioTek BioStack结合，EL2022世界杯附加赛决赛406可用于该试验的液体处理过程的自动化。
三聚氰胺酶联免疫吸附法(ELISA)具有检测十亿分之一(PPB)范围内三聚氰胺污染的能力。这对于许多应用来说是足够的，因为FDA的消费指南列出了超过1ppm的危险水平。FDA的方法采用LC/MS或GC/MS，具有灵敏度高、能同时检测三尿酸的优点。然而，这些方法也需要更昂贵的仪器，更广泛的样品制备之前的分析，和更高程度的技术培训的技术人员进行分析。在许多情况下，当有大量的样本和结果的时间是关键的时候，ELISA方法可以作为筛选工具。
图4。三聚氰胺浓度曲线。基于零标准的B/Bo计算使用安捷伦BioTek Gen5数据分析软件从三个不同的板确定。2022世界杯附加赛决赛使用GraphPad5绘制数据。每个数据点代表总共72个测定的平均值和扫描电镜。
结论
半自动化的ELISA程序，如三聚氰胺试验，允许无人看管的处理许多检测板。虽然这种检测方法并不完全是“步行式”的，但耗时的液体处理步骤，如试剂添加、清洗和孵育已经实现了自动化。加工后，用吸光度读取器手动读取印版。一旦测量了吸光度，B/Bo的计算，标准曲线的生成和曲线的插值测定样品浓度由安捷伦BioTek Gen5数据分析软件自动执行。2022世界杯附加赛决赛