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用吖啶橙测定乙醇处理斑马鱼胚胎的细胞死亡

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2017年12月27日

使用安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Gen5微板阅读器和成像仪软件分析斑马鱼胚胎的细胞死亡

作者: Sarah Beckman，博士，安捷伦科技公司

摘要

在胎儿发育过程中接触乙醇会对胎儿产生毁灭性的影响。该研究使用斑马鱼，一个研究正常发育和毒性的优秀模型，以确定在发育过程中乙醇暴露的影响。在发育的头24小时内用乙醇处理斑马鱼胚胎，并用吖啶橙染色法评估乙醇处理对细胞死亡的影响。研究发现，胚胎暴露于乙醇会导致胚胎整体细胞死亡的剂量依赖性增加。

简介

在人类和动物模型中，母亲饮用酒精饮料而接触乙醇与发育异常有关。1酒精是致畸剂，会对发育中的胚胎和胎儿产生毁灭性的影响。人类在发育过程中接触乙醇可能导致胎儿酒精综合征(FAS)。每年在美国出生的儿童中大约有1 / 100患有FAS。2胎儿暴露于酒精后的结果范围很广，包括生长迟缓、颅面畸形和中枢神经系统畸形。3.此外，妊娠期接触酒精的后果是一个重大的公共卫生问题，影响广泛，代价高昂。3.

斑马鱼是研究发育毒性的优秀脊椎动物模型，因为它们与高等脊椎动物具有相同的分子、生化、细胞和生理特征。此外，透明胚胎在外部迅速发育，这使得可以持续观察到发育过程中的变化。这极大地促进了发展时间过程的研究。斑马鱼是研究调节对发育毒素(如乙醇)的敏感性和抵抗力的基因的强大模型。1先前的研究表明，斑马鱼胚胎在接触乙醇后会产生一系列影响，包括眼睛发育异常、体长缩短和死亡率升高。由于这一簇缺陷与人类FAS重叠，斑马鱼是研究乙醇对发育影响的极好模型。4

乙醇是一种公认的发育毒性物质，但其细胞和分子毒性机制尚不清楚。细胞死亡被认为是乙醇依赖性毒性的一个潜在解释。动物模型在FAS的研究中发挥了至关重要的作用，包括证实酒精是致畸剂，并为酒精发挥作用的机制提供了见解。5在胚胎或胎儿发育的不同阶段，过度的细胞死亡被报道为乙醇诱导的神经系统发病机制的基础。在胚胎期，小鼠神经嵴细胞易受乙醇诱导的细胞毒性作用。6在发育中的大鼠前脑，乙醇引发广泛的凋亡神经退行性变。7在斑马鱼模型中，乙醇诱导整个胚胎的细胞死亡，包括视网膜和中枢神经系统。1

在发育中的动物中，乙醇暴露已被证明通过凋亡诱导细胞死亡。细胞凋亡是多种组织器官系统正常发育的重要组成部分。凋亡细胞的死亡过程是高度保守的，并遵循形态学上独特的模式。细胞凋亡描述了特定的细胞收缩、膜泡、核凝结和核碎片，通常被认为是这种类型的细胞死亡的标志。这一过程受到严格的控制，可以由包括乙醇在内的发育毒素诱导。9

本研究采用吖啶橙(AO)染色结合Agilent BioTek Gen5微板读取器和成象软件，测定了在乙醇暴露24小时后斑马鱼胚胎2022世界杯附加赛决赛中凋亡细胞的死亡数量。本研究还进行了图像处理和分析，从图像堆栈中生成聚焦图像，然后利用Gen5的对象掩蔽能力，计算每个胚胎中绿色AO阳性细胞的数量，并确定AO荧光总量。

材料和方法

斑马鱼保养

斑马鱼基本上和《西部田野》中描述的一样。10成年斑马鱼，包括雄性和雌性，混合并保持在28°C, 14/10小时的明暗循环。为了收集胚胎，雄性和雌性斑马鱼在前一天晚上被放入饲养员的篮子里，并在早上收集胚胎。将斑马鱼胚胎置于28℃培养箱中，E3培养基中(5 mM NaCl, 0.33 mM MgSO4, 0.33 mM CaCl)2， 0.17 mM KCl, 0.1%亚甲基蓝)。

乙醇处理

收集斑马鱼卵，进行分类以去除死亡和未受精的胚胎，并以每孔<10个胚胎的密度放置在24孔培养板中。胚胎在64细胞期用乙醇处理24小时。

吖啶橙染色

用重要染料吖啶橙对活斑马鱼胚胎进行染色，以确定每个胚胎的凋亡细胞数量。11为了进行检测，胚胎被放置在E3培养基中10µg/mL的AO (Sigma, St. Louis, MO)中。染色60分钟后，胚胎在E3培养基中洗涤三次。染色后，胚胎转移到圆形底部96孔板进行成像(康宁，部件编号4520，康宁，纽约州)。

成像

图像是在安捷伦BioTek上使用2x物镜获得的2022世界杯附加赛决赛狮心王外汇自动显微镜配置一个明亮的视野和一个绿色荧光光立方体。GFP光立方使用469/35激励滤波器和525/39发射滤波器。在亮场和GFP通道中拍摄了大量的图像。共取12叠，每叠高12µm，共144µm。

图像处理

采用两个预处理步骤对Lionheart FX获得的GFP图像栈进行分析。在进行图像分析之前，使用z投影下的Focus Stack选项将GFP图像堆栈压平为一张图像(图1A，表1)。

然后用5 μ m滚动球对图像投影进行预处理，以获得个体细胞之间的最佳区分(图1B，表2)，或者用15 μ m滚动球对图像投影进行预处理，以减少背景荧光(表3)。成像预处理和分析参数详见表1至表3。

图像分析

对于细胞分析，根据表2(图1C)列出的参数，在GFP通道上执行对象计数分析，以突出显示每个单个细胞。

吖啶橙点计数工作流程。

图1．吖啶橙点计数工作流程。(A)使用焦点叠加后的2x图像生成z投影(B)对图像堆栈进行预处理后的图像。(C) 1-10 μ m的靶膜以粉色突出。突出显示的细胞为斑马鱼胚胎中的吖啶橙阳性凋亡细胞。

表1．2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5图像分析软件设置为z投影。z-project函数创建从图像堆栈投影的聚焦图像。

Gen5图像分析软件设置z投影。

表2。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5微生物板阅读器和成像软件设置的细胞计数。图像预处理从产生的图像中去除背景，以方便图像分析。图像分析参数在GFP通道中生成细胞掩膜，以计数每个胚胎中的ao染色细胞。

Gen5图像分析软件设置的细胞计数。

表3．2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5图像分析软件设置用于确定AO积分。图像预处理从产生的图像中去除背景，以方便图像分析。图像分析参数在GFP通道中生成一个细胞掩膜来勾勒整个斑马鱼，这使得AO荧光的积分可以在胚胎内确定。

Gen5图像分析软件设置用于确定GFP积分。

在分析图像以确定总AO荧光的情况下，在GFP通道中创建一个初级掩膜以包围整个胚胎(表3)。然后，使用Gen5确定整个胚胎的AO荧光总分。

结果与讨论

从64细胞阶段开始，用0、0.1或0.3%的乙醇处理斑马鱼胚胎24小时。治疗后直接用AO染色来标记凋亡细胞。染色后，将斑马鱼胚胎洗涤三次，并用三卡因处理，直到静止不动，放置在96孔圆形底板中进行成像，如图2所示。分别在亮场和GFP通道上采集图像堆栈。

斑马鱼在圆底96孔板。

图2。斑马鱼在圆底96孔板。将0%乙醇(A,C)或0.3%乙醇(B,D)处理过的斑马鱼放入圆形底部96孔板中，然后在亮场(A,B)和GFP (C,D)通道中以2倍物镜进行图像堆叠。所有胚胎的位置大致是横向的，在孔的中心。

然后利用Gen5的Focus Stack函数将图像栈压平，对得到的图像进行预处理，去除背景AO染色。然后利用Gen5软件的细胞计数功能确定每个胚胎的ao阳性细胞数。

图3为预处理后AO阳性细胞大小的直方图。斑马鱼的细胞比哺乳动物的细胞小，细胞大小从3到12 μ m不等。12在这种情况下，平均看到4.82 μ m，这是合理的，因为用于处理图像的滚动球是5 μ m。

预处理后分析细胞大小。

图3。预处理后分析细胞大小。

乙醇已被证明可诱导斑马鱼胚胎中的细胞死亡，而且随着乙醇浓度的增加，每个胚胎中AO阳性细胞的数量也会增加。0.1%和0.3%乙醇处理组每个胚胎的AO阳性细胞数量均显著高于对照组(图4)。

在胚胎中，GFP通道荧光的增加与AO染色的增加和细胞死亡的增加相关。因此，另一种分析数据的方法是测定每条斑马鱼GFP通道中的整体荧光。在这种情况下，在每个胚胎周围创建掩膜(如图5中红色部分所示)，使用Gen5软件计算每个胚胎中AO荧光的积分。与细胞计数数据一样，我们发现，随着乙醇处理量的增加，AO荧光增加，这与胚胎中细胞死亡的剂量依赖性增加相对应(图5)。

斑马鱼胚胎的细胞死亡在乙醇处理后以剂量依赖性的方式增加，可见GFP阳性细胞的数量。

图4。．用乙醇处理斑马鱼胚胎后，细胞死亡以剂量依赖性的方式增加，从一些ao阳性细胞可以看出。在GFP通道中显示了用0 (A,D)， 0.1% (B,E)和0.3% (C,F)乙醇处理的吖啶橙染色胚胎的图像堆栈。预处理后的图像与粉红色的面具周围的ao阳性细胞显示为每次治疗。随着乙醇浓度的增加，凋亡细胞的数量也会增加。定量结果见图e。随着乙醇含量的增加，每个胚胎的凋亡细胞数量呈剂量依赖性增加。0.1%乙醇和0.3%乙醇处理的细胞死亡率均显著高于对照组(*p <0.05)。

斑马鱼胚胎细胞死亡在乙醇处理后呈剂量依赖性增加，表现为GFP表达。

图5。AO荧光显示，经乙醇处理后，斑马鱼胚胎细胞死亡呈剂量依赖性增加。胚胎处理0 (A)， 0.1% (B)，或0.3% (C)乙醇显示。在每个胚胎周围建立图像掩膜，使用Agilent BioTek Gen5软件计算每个胚胎的AO荧光积分。2022世界杯附加赛决赛(D) AO荧光积分呈剂量依赖性升高，0.1%和0.3%乙醇处理均显著高于对照组(*p <0.05)。

结论

以高通量的方式分析斑马鱼胚胎细胞死亡的能力对毒理学筛查至关重要。这一应用笔记表明，经乙醇处理的斑马鱼的凋亡细胞死亡有剂量依赖性的增加。使用吡啶橙染料结合Agilent BioTek Gen5微板阅读器和成像软件，可以快速一致地分析96孔2022世界杯附加赛决赛板中活斑马鱼胚胎中ao阳性凋亡细胞的数量。对每个胚胎AO染色水平的分析显示，AO荧光的增加与细胞死亡的增加相关。

参考文献

  1. 卡万，M. J，劳克斯，E.，韦伯，D. N.和威廉姆斯，F. E.乙醇对发育中的斑马鱼的影响:神经行为和骨骼形态发生。神经毒理学Teratol 26, 757-68(2004)。
  2. Lovely, c.b, Fernandes, Y. & Eberhart, J. K.胎儿酒精谱系障碍的捕鱼:斑马鱼作为乙醇畸形发生的模型。斑马鱼13,391-8(2016)。
  3. 莱利，E. P, Infante, m.a. & Warren, K. R.胎儿酒精谱系障碍:概述。神经心理学杂志21,73-80(2011)。
  4. 阿里，S.，香槟，D. L.，阿里，a . &理查森，M. K.斑马鱼发育过程中急性乙醇暴露的大规模分析:一个关键的时间窗口和恢复力。科学通报6,e20037(2011)。
  5. Murawski, n.j, Moore, E. M, Thomas, J. D.和Riley, E. P.胎儿酒精谱系障碍的诊断和治疗进展:从动物模型到人体研究。酒精Res 37,97 - 108(2015)。
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  9. 科尔，LK和罗斯，LS。斑马鱼胚胎发育中的细胞凋亡。发育生物学240,123-142(2001)。
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