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NIH3T3细胞中aktpan激酶受体介导的刺激

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2020年10月8日

使用安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k Synergy Neo2多模式阅读器测量THUNDER TR-FRET细胞信号分析

作者: Paul Held,博士,安捷伦科技公司

摘要

细胞增殖通常通过细胞表面受体启动,受体与特定的配体相互作用。这种相互作用引起信号级联,从细胞表面传递到细胞核。信号级联涉及到特定蛋白激酶的磷酸化对蛋白质的激活。AKT pan是该信号通路中的关键蛋白,可被磷酸化激活。因此,监测该蛋白的磷酸化状态的能力可以洞察培养细胞的生长状态。本应用说明书描述了使用THUNDER TR-FRET检测试剂盒联合安捷伦BioTek对NIH3T3成纤维细胞PDGF刺激后磷酸化akt pan (S473)的定量2022世界杯附加赛决赛协同Neo2

简介

血小板衍生生长因子(PDGF)刺激间充质细胞增殖、迁移和存活,在胚胎发育和伤口愈合过程中发挥关键作用。1二价配体的结合诱导PDGF受体的二聚和激活,导致胞内酪氨酸残基的自磷酸化。2结果,多个信号转导通路启动,包括磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、Src酪氨酸激酶、磷脂酶Cγ (PLC)和几个丝裂原激活蛋白(MAP)激酶级联(图1)。

细胞增殖的PDGF受体通路示意图。
图1
.细胞增殖的PDGF受体通路示意图。

AKT又称蛋白激酶B,是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶,在糖代谢、凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移等多种细胞过程中发挥关键作用。3.AKT通过抑制凋亡过程参与细胞生存途径。AKT也能诱导蛋白质合成通路,因此是导致一般组织生长的细胞通路中的关键信号蛋白。由于AKT可以抑制细胞凋亡并促进细胞存活,因此它被认为是多种癌症的主要因素。

AKT的Pleckstrin同源结构域直接与磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(PIP3)和磷脂酰肌醇(3,4,2)-二磷酸(PIP2)结合,这是由激活的pi3k产生的。4因为这两种化合物都局限于质膜,AKT结合导致其转位到质膜。

一旦正确定位在细胞膜上,AKT就可以被其激活的激酶磷酸化,哺乳动物雷帕霉素复合物2 (mTORC2)在丝氨酸473位点的靶点,随后是磷酸肌苷依赖激酶1 (PDPK1)在苏氨酸308位点的靶点。5激活的AKT可以继续通过其激酶活性激活或失活其无数底物(如mTORC1)(图1)。

Wortmannin是一种非特异性、不可逆的磷酸肌苷3激酶(PI3Ks)抑制剂。Wortmannin是真菌Penicillium funiculosum和Talaromyces wortmannii的类固醇代谢物(图2)。该化合物具有高度活性的C20碳,共价结合磷酸肌醇3激酶(PI3Ks)在其活性位点并抑制其活性。通过抑制PIP3和PIP2的形成,AKT不能转移到膜上,在S473位点被磷酸化。

Wortmanin结构

图2。wortmanin结构

Phospho-AKT pan (S473)检测是一种均匀时间分辨Förster共振能量转移(TR-FRET)夹层免疫检测(图3)。细胞处理后,细胞用试剂盒中提供的特异性裂解缓冲液裂解。然后用一对荧光团标记抗体检测细胞裂解物中的Phospho-AKT pan (S473)。一种抗体用供体荧光团(铕螯合物;Eu-Ab1)和第二个具有远红受体荧光团(FR-Ab2)。两种标记抗体与目标蛋白上不同的表位结合发生在溶液中,使两种染料靠近。供体铕螯合分子的激发触发了从供体分子到受体分子的FRET,进而在665 nm处发出TR-FRET信号。这种反应只能在特定分析物存在的情况下发生。铕螯合物的剩余能量产生615纳米的光。665 nm处的信号与细胞裂解液中Phospho-AKT pan (S473)的浓度成正比。数据可以表示为信号在665 nm或665 nm/615 nm的比值。

THUNDER™试验的TR-FRET反应示意图。

图3。THUNDER试验的TR-FRET反应示意图。

Synergy Neo2是一种多模微板读取器,可以配置337 nm激光,专门设计用于基于镧系铕的TR-FRET分析的激发。除了激光作为激发波长外,基于滤波器的光学系统还使用二色镜和深阻塞带通滤波器进行发射分辨。光信号是使用直接无光纤光学与多个pmt捕获双信号输出同时。

材料与方法

Phospho-AKT pan (S473)检测试剂盒,kit - akts473p -500,来自BioAuxillium (QC, Canada)。胎牛血清、Advanced-DMEM和谷氨酰胺-笔-链球菌购自Life Technologies (Carlsbad, CA)。黑色的,底部96孔(3904)和固体白色,低体积384孔(3674)微板来自康宁(Corning, NY)。冻干的PDGF-AA (221-AA)来自R&D Systems (Minneapolis, MN),并按指示在4 mM HCl中再水化至100µg/mL。

细胞培养

NIH3T3细胞在添加10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和青霉素-链霉素的高级DMEM培养基中培养,37℃,5% CO2.培养物常规胰酶化(0.05%胰蛋白酶- edta),符合率为80%。在实验中,细胞被镀到康宁3904黑边透明底96孔微板中。除非另有说明,细胞在添加10% FBS 2 mM谷氨酰胺和青霉素-链霉素的Advanced-DMEM中以每孔10000个细胞的密度进行接种,并允许其过夜。第二天改用添加0.1% FBS 2 mM谷氨酰胺和青霉素链霉素的高级dmem培养基。实验前细胞暴露于低血清24小时。

试验过程

使用双板转移协议进行检测。刺激后,用每孔50µL的1x裂解缓冲液溶解细胞,其中添加1mm氟化钠和2mm原钒酸钠磷酸酶抑制剂。裂解缓冲液由检测试剂盒提供,浓度为5倍,使用前立即用MilliQ水稀释。裂解在轨道微板摇床上进行,转速400转,持续60分钟。裂解后,每种裂解物的15µL转移到一个384孔的白色固体检测板上,接着是5µL的4x抗体混合物。4x抗体混合物包括在1x检测缓冲液中的铕标记的Phospho-AKT pan (S473)抗体(铕- ab1)和受体标记的Phospho-AKT pan (S473)抗体(FR-Ab2)混合物,并在使用前立即按照检测说明中的指示制备。用胶粘剂封板,室温下静置4小时。

检测

使用配备了377 nm激光激发源的Synergy Neo2读取检测板。发射检测使用双发射620和665 nm滤波器组,两个pmt的增益设置为100。每次测量是20个数据点的平均值。每个数据点的使用延迟为50µs。采集时间为100µsec(表1)。

表1。Synergy Neo 2读取双发射TR- FRET测量参数。

表1

数据简化

捕获的分析数据首先通过从相应波长的实验孔中减去620 nm和665 nm处的几个空孔的平均信号来消隐。trr - fret比的计算方法是:将消隐的665 nm发射信号除以消隐的620 nm发射信号,并将该值乘以1000。然后根据需要绘制TR-FRET比率。

结果与讨论

数据表明,小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞系可以被刺激磷酸化AKT蛋白S473位点。如图4所示,当NIH3T3细胞被刺激15分钟时,PDGF产生磷酸化akt pPan (S473)的浓度依赖性增加。

PDGF对AKT pan (S473)磷酸化的刺激。

图4。PDGF对AKT pan (S473)磷酸化的刺激。NIH3T3细胞(10000细胞/孔)与PDGF-AA系列稀释液在37°C孵育15分钟,然后裂解。

PDGF的刺激反应可被化合物渥曼宁所抵消。在用PDGF刺激NIH3T3细胞之前,将NIH3T3细胞与不同浓度的渥曼宁孵育30分钟,观察到刺激反应的浓度依赖性抑制(图5)50wortmannin的浓度为56 nM。

抑制AKT激酶磷酸化(S473)。

图5.Wortmannin抑制AKT激酶磷酸化(S473)。NIH3T3细胞(10000细胞/孔)与连续稀释的Wortmannin在37°C孵育30分钟。然后用10 nM的PDGF-AA在37°C下刺激细胞15分钟,然后溶解。

对使用10 nM PDGF处理的井和未使用PDGF处理的井的比较表明,该测定方法相当可靠。phospho-AKT pan (S473)试验的定量窗口是基础水平的6倍(图6)。经10 nM PDGF刺激的细胞的平均TR-FRET比被确定为180,而未处理的孔观察到的比值为30。本实验计算的Z'-因子为0.722,表明信号变化与未受刺激的对照细胞有显著差异。

NIH3T3细胞Z ' -因子的测定。NIH3T3细胞(10000细胞/孔)与10 nM PDGF-AA在37°C孵育15分钟,然后裂解。

图6.NIH3T3细胞Z'-因子的测定。NIH3T3细胞(10000细胞/孔)与10 nM PDGF-AA在37°C孵育15分钟,然后裂解。每个处理组共使用36口井确定Z'-因子。

在细胞数量方面,这种测定是定量的。如图7所示,将不同数量的NIH3T3细胞接种到96孔微板中,用PDGF刺激,观察到在TR-FRET比下,NIH3T3细胞的数量呈线性关系。与无细胞对照相比,只有2500个细胞可以被区分,尽管有一个小的检测窗口。在较高的细胞浓度(20,000个细胞/孔),充分的细胞裂解和细胞过度生长成为问题,导致更多的样品变动性。对于NIH3T3细胞,每孔10000到15000个细胞的种子密度被发现可以提供足够的检测窗口和一致的裂解。表2所示的S/B和Z'-因子分析证实了这些数据。当每孔接种10 ~ 15K细胞时,S/B比为8 ~ 10,Z′因子约为0.75。

NIH3T3细胞数滴定。

图7.NIH3T3细胞数滴定。NIH3T3细胞以不同的播种密度接种到96孔板中。经过一夜的附着和24小时的血清饥饿后,细胞被10 nM PDGF刺激在37°C下15分钟,然后溶解。

表2。不同细胞播种密度的信本比和Z'因子。NIH3T3细胞以不同的播种密度被播种到96孔板中。经过一夜的附着和24小时的血清饥饿后,细胞被10 nM PDGF刺激在37°C下15分钟,然后溶解。数据表示每个数据点的统计数据。

不同细胞播种密度的信本比和Z'因子

血小板衍生生长因子(PDGF)是调节细胞生长和分裂的众多生长因子之一。特别是,PDGF在血管形成、已有血管组织的血管生长、间充质细胞如成纤维细胞、成骨细胞、腱细胞、血管平滑肌细胞的有丝分裂即增殖等过程中发挥着重要作用。这些数据表明,PDGH刺激NIH3T3细胞可促进AKT激酶S473位点的磷酸化。此外,PKI3K抑制剂wortmannin的加入可以抵消这种刺激作用。在这些实验中使用的phospho-AKT pan (S473)的THUNDER TR-FRET细胞信号分析是一种稳健且易于操作的分析方法,如高Z′值所示。

细胞信号生物学是复杂的,涉及到许多蛋白质,这些蛋白质受到许多动态的翻译后修饰的调节。THUNDER分析组合提供了一系列使用相同的添加-孵育-测定格式运行的分析。这些均质分析不需要任何清洗步骤,可以在一天内完成。从实验中得到的细胞裂解物可以保持在-80°冷冻,并作为一个组进行分析,以提高分析试剂的效率。本研究使用一个96孔板进行细胞实验,使用一个单独的低容量384孔板进行检测步骤(双板分析方案),在分析试剂盒说明书中提供了单板分析方案。THUNDER检测试剂盒提供了除磷酸酶抑制剂外进行检测所需的所有试剂。虽然对检测是绝对必要的,但正确的磷酸酶抑制剂鸡尾酒混合将取决于所讨论的分析物,需要新鲜制备。

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Synergy Neo2混合多模式阅读器是测量TR-FRET反应的理想平台,如BioAuxillium的THUNDER分析。Synergy Neo2可以配置后机匣激光器和多达4个pmt,允许高通量的分析开发和筛选。这允许同时捕获620和665纳米的发射。这种无纤维设计为非常强的样品激发提供了直接照明,保证了最高水平的灵敏度。该光学系统使用含有二色镜和深阻塞带通滤波器的条形码滤波器立方体,用于无误差地测定激发和发射。读取器由安捷伦BioTek Gen5数据分析软件进行控制和数据还原。2022世界杯附加赛决赛这种分析技术、软件和仪器的结合为各种应用的高通量检测提供了理想的解决方案。

参考文献

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