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斑马鱼胚胎血管生成的定量显微镜研究

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2018年12月06日

利用Agilent 2022世界杯附加赛决赛BioTek Gen5酶标仪和成像仪软件研究血管生成抑制

作者: Sarah Beckman,博士,安捷伦科技有限公司

摘要

血管生成紊乱对许多疾病都有影响,包括癌症和缺血性心脏病。本研究利用转基因斑马鱼分析VEGF抑制剂治疗24小时后血管发育情况。这是利用控制胚胎和处理胚胎的延时图像叠加,结合安捷伦BioTek的掩蔽功能完成的2022世界杯附加赛决赛Gen5微孔板阅读器和成像仪软件来确定血管面积随时间的变化。本应用说明表明血管生长被VEGF抑制剂以剂量依赖性的方式抑制。

简介

循环系统是脊椎动物发育过程中最先开始发挥功能的系统之一,它的准确组装对胚胎的正常发育和模式形成至关重要。血管发育的特征有两个基本特征:生成新血管向灌注不足的区域供应血液,以及消除不能维持正常血液流向身体组织的血管。1血管影响所有其他组织,为它们提供维持生命所需的氧气和营养物质,因此,了解它们在正常和紊乱状态下的功能是至关重要的。

血管新生是指在原有的血管系统中形成新的血管的过程。血管生成是一个复杂而受控制的过程,内皮细胞的迁移、增殖、激活等各个方面都受到促进或抑制血管生成的因素的严格调控。

血管生成在包括胚胎发育、组织修复和疾病在内的许多条件下起着至关重要的作用。血管生长不充分会导致组织缺血,而过度的血管生长则会促进癌症和炎症性疾病。2增强血管新生作为一种修复性治疗是再生医学的一个主要目标,特别是针对心肌梗死等缺血性疾病。另一方面,抑制血管生成是癌症生物学领域的一个重要领域。已有研究表明,实体肿瘤的生长和转移需要肿瘤血管生成。3.因此,抑制血管形成是癌症治疗的一个潜在目标。

许多参与胚胎发育的途径与成人疾病有关。斑马鱼的血管发育就是一个很好的例子。斑马鱼有一个封闭的循环系统,发展中的血管系统的形式,用来组装血管的过程,以及血管形成的分子机制与人类非常相似。4此外,斑马鱼为研究血管发育提供了许多独特的优势在活的有机体内.斑马鱼的胚胎在体外发育,因此很容易进行操作。此外,它们的光学透明度有助于对发育中的胚胎中的血管进行高分辨率成像。

受精后大约24小时(hpf),斑马鱼胚胎开始循环。最初,血液流经一个简单的循环循环。躯干的节间血管(isv)是脊椎动物中最早形成的血管。节段间血管形成的多步骤过程始于背主动脉冒出的一组芽,并沿着体缘生长。当它们到达神经管背侧面时,生长中的血管段分支并相互连接形成背侧纵向吻合血管(DLAV)(图1)。1

斑马鱼受精后2天尾部血管解剖。

图1所示。斑马鱼受精后2天尾部血管解剖。图中为转基因斑马鱼kdrl:mcherry 10x堆叠。

血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成的主要调节因子。VEGF在新生血管附近表达。内皮细胞表达VEGF受体2 (VEGFR2)(也称为kdrl),一种酪氨酸激酶受体,驱动内皮细胞对VEGF的有丝分裂和趋化反应。5VEGF对isv的形成很重要。它是由ISV芽迁移之间的体产生和分泌的,VEGFR2功能的丧失会抑制ISV的形成。VEGFR2和VEGFR1主要表达在前体细胞和成熟内皮细胞上,并被强烈暗示在血管生成中发挥直接作用。例如,成熟内皮细胞的发育和有丝分裂需要VEGFR2。5

血管模式在发育中的斑马鱼胚胎中具有高度的特征,而isv可以在显微镜下被视为影响血管生成的化合物的主要筛选物。直接添加到鱼水中的小分子会扩散到胚胎中,并诱导可观察到的剂量依赖性效应,这种效应可以通过图像分析算法进行量化。6

本研究使用Tg(kdrl:mcherry)7结合延时成像和Gen5微孔板读取器和成像软件,分析VEGF抑制剂治疗24小时后血管面积的减少。本研究取对照胚和处理胚的延时图像栈,利用Gen5的掩蔽功能确定血管区域。

材料和方法

斑马鱼的维护

在韦斯特菲尔德,斑马鱼基本上被维持着。8成年斑马鱼,包括雄斑马鱼和雌斑马鱼,混合在28°C, 14/10小时的光照/黑暗周期。为了收集胚胎,雄性和雌性斑马鱼在前一天晚上被放入繁殖筐,胚胎在第二天早上收集。将斑马鱼胚胎置于28°C培养箱中E3培养基(5 mM NaCl, 0.33 mM MgSO)中4, 0.33 mM CaCl20.17 mM KCl和0.1%亚甲基蓝)。

VEGF抑制剂治疗

胚胎被放置在1%低熔体琼脂糖中,并以背侧的方式放置在底部透明的黑色边96孔板(Corning, Corning, NY)中。然后用VEGF受体抑制剂SU5416或舒尼替尼(Tocris, Minneapolis, MN)处理斑马鱼胚胎。在一个实验中,28个hpf胚胎分别使用SU5416(2.5µg/mL, 1.25µg/mL, 0.65µg/mL, 0µg/mL)处理。用舒尼替尼100 μ g/mL、25 μ g/mL、6.25 μ g/mL和0 μ g/mL处理25个hpf胚胎。所有处理均用E3培养基稀释,96孔板的每孔加入100µL。

成像

图像是使用安捷伦BioTek上的10倍目标获取的2022世界杯附加赛决赛狮心王外汇配有德州红光立方体的自动显微镜。在每口井中,在卵黄囊的末端放置一个信标(图2)。在信标周围的brightfield和Texas Red通道拍摄了大量的图像。每个胚胎取10组,每组17µm。

10倍图像相对于1 dpf斑马鱼胚胎的位置。

图2。10倍图像相对于1 dpf斑马鱼胚胎的位置。在卵黄囊的末端创建信标,这样所产生的图像就被设置在胚胎的躯干周围。

图像分析

采用聚焦叠加法将10张图像叠加成一张聚焦图像。然后,利用背景自动平坦化参数从德克萨斯红通道中去除背景荧光。在亮场通道中不需要加工。然后设置物体掩蔽阈值来识别血管区域。通过掩蔽德克萨斯红通道来分析图像。表1详细介绍了图像预处理和分析设置。

表1。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5微孔板阅读器和成像仪软件设置Z投影,图像预处理和细胞分析。Z投影创建一个聚焦的图像堆栈。图像预处理从叠加图像中去除背景,便于对脉管系统进行掩蔽。细胞分析在血管周围创建一个遮罩来计算血管面积。

用于Z投影,图像预处理和细胞分析的Gen5微孔板阅读器和成像仪软件设置。

结果与讨论

转基因斑马鱼胚胎经SU5416处理后,观察药物对斑马鱼发育过程中1 dpf血管生成的影响。胚胎在当天晚些时候进行处理,大约在28到30 hpf。SU5416是一种VEGFR抑制剂,对VEGFR2的催化活性有选择性。9通过1dpf形成由背主动脉和轴静脉组成的简单循环系统。isv的萌芽也已经开始了。

研究结果表明,与对照组相比,SU5416处理抑制了血管的生长,这是剂量依赖的(图3)。这导致了血管面积的变化,未处理的血管面积增加到初始面积的1.8倍,而最高剂量2.5 ug/mL处理的胚胎只增加了其面积到初始面积的1.2倍。

斑马鱼也使用舒尼替尼处理,舒尼替尼是一种小分子,可以抑制受体酪氨酸激酶家族成员,包括VEGF受体1和2和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)。抑制这些受体酪氨酸激酶阻断信号转导影响过程涉及血管生成。10这些胚胎处理稍早于舒尼替尼处理的胚胎,在1 dpf或约25 hpf的最开始。研究结果表明,与剂量依赖的对照胚胎相比,使用类似于SU5416的舒尼替尼处理可以抑制血管生长(图4)。这导致血管面积的变化,未处理的血管面积增加到初始面积的3倍左右,而使用最高剂量100 ug/mL处理的胚胎只增加了其面积到初始面积的1.5倍。

用SU5416处理后,血管生长呈剂量依赖性下降。

图3。SU5416的治疗以剂量依赖性的方式导致血管生长下降。(A) Tg(kdrl:mcherry)斑马鱼10倍图像。上排为处理前,下排为处理后24小时。(B)血管面积图,显示了舒尼替尼治疗后血管面积的变化。(C) 24小时剂量反应曲线,抑制剂剂量越大,面积越小。

舒尼替尼治疗以剂量依赖的方式导致血管生长下降。

图4。舒尼替尼治疗以剂量依赖的方式导致血管生长下降。(A)转基因斑马鱼的10倍图像。上排为处理前,下排为处理后24小时。(B)血管面积图显示舒尼替尼治疗的剂量反应。(C) 24小时剂量反应曲线。

结论

血管生成是一个至关重要的发育过程,也是从癌症到心脏病等各种疾病的重要治疗靶点。本研究分析了VEGF抑制剂处理转基因斑马鱼胚胎24小时后血管面积的减少。正如预期的那样,SU5416和舒尼替尼治疗后血管面积出现了剂量依赖性的减少。使用安捷伦BioTek Ge2022世界杯附加赛决赛n5微孔板阅读器和成像仪软件进行分析,可以一致和无偏倚地确定血管面积。

参考文献

  1. Ellertsdóttir, E.等。斑马鱼胚胎中的血管形态发生。生物医学杂志。341,56 - 65(2010)。
  2. Chávez, M. N., Aedo, G., Fierro, F. A., Allende, M. L. & Egaña, J. T.斑马鱼作为研究发育和再生中血管生成的新兴模式生物。前面。Physiol. 7,1 - 15(2016)。
  3. 贝茨,C,伦纳德,A,贝尔廷,h - g。血管生成过程中m细胞的行为和动态。发展143,2249-2260(2016)。
  4. Ungos, J. & Weinstein, b.m.《斑马鱼血管发育》,301-332(2007)。doi: 10.1016 / S1574 - 3349 (07) 18012 - 1
  5. Cébe-Suarez, S., Zehnder-Fjällman, A. & Ballmer- Hofer, K. VEGF受体在血管生成中的作用;复杂的伙伴关系。细胞。摩尔。生命科学。(2006)。doi: 10.1007 / s00018 - 005 - 5426 - 3
  6. 马斑鱼血管生成:一种新的药物筛选模型。血管生成3,353 - 9(1999)。
  7. 王勇,等。内皮细胞需要Moesin1和Ve-cadherin在活的有机体内tubulogenesis。开发137,319 - 3128(2010)。
  8. 《斑马鱼之书》。斑马鱼实验室使用指南,第5版。俄勒冈大学出版社。尤金(2007)。
  9. 方,t.a.t.等人。SU5416是抑制酪氨酸激酶催化、肿瘤血管化和多种肿瘤类型生长的血管内皮生长因子受体(Flk-1 / KDR)的有效和选择性抑制剂。Cancer Res. 5999 - 106(1999)。
  10. Chow, l.q. M. & Eckhardt, s.g.舒尼替尼:从合理设计到临床疗效。j .中国。Oncol. 25, 884-896(2007)。AN120318
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