滤光吸收光谱法监测蛋白质脱氢酶活性

作者: Peter J. Brescia, Jr.和Peter Banks，安捷伦科技有限公司

摘要

用微孔板分光光度计测定了乙醇脱氢酶的酶动力学。醇底物乙醇和2-丙醇显示K_{毫克ydF4y2Ba}9.7毫米和210毫米和V_马克斯50和33 μmol min^－1,分别。

简介

吸光度法是一种在广泛领域有着悠久应用历史的分析方法。酶联免疫吸附法(ELISA)和依赖于紫外线吸收和比色吸收的分析在各种实验室环境中进行，包括学术界的基础研究和临床实验室测试。许多这些分析已经发展到包括更高的通量格式，需要使用微板和专用仪器。仪器仪表有多种配置，从超高灵敏度，单波长光源仪器到基于单色仪的宽范围波长选择平台。随着复杂性的增加，成本和培训要求也在增加。许多应用都可以使用具有成本效益的仪器，使用安装的带通滤波器，提供波长选择以及出色的灵敏度。本应用说明展示了基于过滤器的吸光度微孔板阅读器用于蛋白质脱氢酶家族成员的酶分析。

一个长期研究的酶家族包括一组乙醇脱氢酶(ADHs)，在各种各样的生物体中发现，它们负责醇与醛或酮之间的相互转化。自1937年发现ADH以来酿酒酵母(啤酒酵母)，来自许多生物的ADHs已经被非常详细地研究过在许多生物体中，主要功能是清除有毒的醇，同时产生有用的化学物质，如酮或相互转化为其他有用的醇。然而，在啤酒和葡萄酒的发酵过程中，ADH可能以其在酵母中反向运行以产生酒精的能力而闻名。酶家族在临床上也被研究其与酒精中毒、药物依赖和中毒的关系，以及工业应用，如燃料电池的催化或手性醇对映体纯立体异构体的生产。^2、3、4

测定原理

醇的酶催化需要减少辅助因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)⁺)转化为还原形式NADH或逆向化学过程生成酒精(图1)。

图1所示。辅助因子NAD⁺．(A) NAD+的化学结构(B) NAD的还原⁺在酶催化过程中转化为NADH

图2显示了NAD还原时的典型吸光度变化⁺变成还原形式的NADH烟酰胺部分的还原产生了一个额外的吸收峰，中心在340 nm。这使得使用辅因子的反应过程可以被动态地监测或作为该波长的端点测量。

图2。NADH和NAD的光谱扫描⁺解决方案。NADH(蓝点)和NAD等分(100 μL)⁺(红点)溶液(1mg /mL)混合到半面积-紫外透明板上，以1nm为增量，从200nm到600nm进行光谱扫描。使用安捷伦BioTek Gen5微板阅读器和成像软件绘2022世界杯附加赛决赛制数据。

材料与方法

标准96孔紫外透明微板(零件号3636)，购买自康宁(图克斯伯里，马萨诸塞州)。NADH校准标准品从Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)购买，作为预称重小瓶(零件号8129)。在teph8.0水溶液缓冲液中制备原液作为稀释剂。用岛津UV - 1700分光光度计(哥伦比亚，MD)在1厘米径比管中340 nm处的吸光度来验证NADH溶液的浓度。在TE缓冲液中进一步稀释，每种稀释量各取160 μL，分三次分布于微孔板孔中。吸光度测量使用安捷伦BioTek2022世界杯附加赛决赛TS 800吸光度读卡器在340 nm。来自贝克酵母的酒精脱氢酶(零件号A3263 - 30KU)和NAD⁺(零件号10127965001)从Sigma - Aldrich购买。

所有酶反应测量都在酶稀释缓冲液(10 mM磷酸钠缓冲液pH 7.5 (10 mM Tris, 0.1% (w/v)牛血清白蛋白)中进行。简单地说，ADH的酶活性是按照制造商的建议在酶稀释缓冲液中重建后，用1厘米比色皿估计的。在160 μL的总体积中进行微板反应，其中32 μL 50mm磷酸盐缓冲液(f.c = 10 mM)和10 μL 15mm NAD⁺在酶缓冲液中加入10 μL ~ 20个单位/mL的ADH，加入50 μL乙醇底物启动。

仪表

安捷伦2022世界杯附加赛决赛BioTekTS 800吸光度读取器用于动态模式下的吸光度读数，或使用340/40 nm带通滤波器作为终点测量。测量通常是每5秒读取一次，持续6分钟。

数据简化

计算了线性动力学区间内每一分钟的吸光度变化。计算值表示反应的最大速度(V_马克斯)吸光度单位每分钟。V_马克斯然后将这些值转换为每毫克ADH蛋白每分钟的μmol NADH (μmol [NADH] min)^－1毫克^－1)由NADH标准曲线内插。测定了不同酒精浓度下的反应速率数据。通过将数据导出到GraphPad Prism (La Jolla, CA)，绘制反应速率数据与酒精浓度的关系，生成Michaelis-Menten图。Lineweaver-Burk图是上述数据的双倒数图，用于确定Michaelis-Menten常数(K_{毫克ydF4y2Ba}和V_马克斯)。

结果

NADH标准曲线

NADH标准曲线采用1:2的TE连续稀释制备，从1cm径径比色皿测定的325 μM原液浓度开始。将每种浓度的160 μL移液至微孔板中，一式三份。将每个孔中NADH的总量与340 nM处的吸光度测量值绘制出来(图3)。然后在Gen5使用最小二乘线性回归拟合，并用于后续测定在与各种醇底物的酶促反应中还原为NADH的辅因子的量。

图3。在340 nm处用吸光度测量NADH浓度曲线。在TE (pH 8.0)水溶液缓冲液中连续稀释0 ~ 0.05 μmol /孔的NADH。使用安捷伦BioTek 800 TS吸光度仪测定吸光度。2022世界杯附加赛决赛2022世界杯附加赛决赛使用Agilent BioTek Gen5微板读取器和成像仪软件进行读取器控制和数据捕获，以及数据的线性回归分析。

酶测定

酶测定分三次进行，每种底物浓度分别加入50 μL酒精底物。运动捕获三次测量，以确保捕获基板的线性部分和辅因子转换。考虑到底物和辅因子消耗的速度快，每个底物浓度都需要连续启动。对酶、辅因子、底物等试剂进行优化，使反应速率达到0.1 OD/min。配制1:2的连续稀释乙醇，使测定中的最终浓度为0.8至100 mM, 2-丙醇为3.9至500 mM。

通过从t = 60秒中减去初始OD，计算每个反应前60秒的初始反应速率。如上所述，对于每种底物浓度，ΔOD340 nm转换为μ mol [NADH] min-1 mg-1，并随底物浓度绘制图。使用标准方法在Graph Prism中生成Michealis -Menten图，随后使用Michaelis-Menten常数生成双倒数linewearer - burk图(图4和表1)。

表1．Michaelis-Menten常数。

图4。酶活性为ADH酿酒酵母．分别以乙醇和2-丙醇为底物，建立了测定K的Michaelis-Menten (A, B)和Lineweaver-Burk图(C, D)_{毫克ydF4y2Ba}和V_马克斯．

结论

基于微板的分析格式是许多需要更高通量或多种实验条件的实验室进行吸收光谱的主力。使用基于滤光片的光学系统进行样品测量的仪器可以提供简单，负担得起的解决方案，简化工作流程和提高吞吐量。使用安捷伦BioTek 800 TS吸光度仪对贝克酵母中的酒精脱氢酶进行分析，说明了一个典型的工作流程解决方案，用于各种酒精底物的动力2022世界杯附加赛决赛学分析，通过监测酶还原NAD后NADH的吸光度⁺_．

参考文献

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