细胞凋亡和坏死的活细胞成像

作者: Sarah Beckman博士安捷伦科技公司

摘要

细胞死亡发生在生物体的整个生命过程中，这对发育可塑性和机体健康至关重要，部分原因是通过及时有效地消除不需要和不健康的细胞。然而，功能失调的细胞死亡会导致癌症、神经退行性变和缺血性损伤等疾病。在这项研究中，我们使用高对比度亮场成像结合荧光探针对凋亡和坏死细胞死亡标记物在48小时内实时研究凋亡和坏死。我们证明了HT-1080和SKOV3细胞的凋亡和坏死以剂量依赖性的方式诱导。

简介

细胞死亡是多种生物过程的重要组成部分，包括细胞的正常周转和正常发育。细胞死亡在细胞种群的内稳态调节中显示出与增殖互补但相反的作用。不适当的细胞死亡(过多或不足)是许多疾病的一个因素，如缺血性损伤、癌症和神经退行性变。¹因此，调节细胞生命或死亡的能力具有巨大的治疗潜力。

细胞死亡的两种典型途径是凋亡和坏死。细胞凋亡是一种主动的、程序化的细胞自主死亡过程，避免引起免疫反应。另一方面，坏死是一个不受控制的被动过程，其结果是炎性细胞质释放到周围组织。对每一个独特的细胞死亡途径至关重要的是产生的细胞碎片的清除方式。凋亡细胞表现出对吞噬细胞的各种识别信号，导致它们的权宜清除。凋亡小体的摄取抑制了激活巨噬细胞炎症介质的分泌。相反，坏死细胞释放出的细胞内容物包括作为信号促进炎症反应的分子。²

细胞凋亡和坏死虽然存在差异，但它们并不是相互排斥的过程。暴露于同一刺激下的细胞可同时发生多种类型的细胞死亡。局部强度，以及特定细胞的激活或分化状态，有助于确定每一个细胞所承担的细胞死亡途径此外，刺激的程度可以决定细胞是死于凋亡还是坏死。在低剂量下，各种损伤性刺激如热、辐射、缺氧和细胞毒性抗癌药物可诱导细胞凋亡，但在高剂量下，同样的刺激可诱导坏死。²

细胞死亡反应的量化是探索细胞生物学、细胞应激反应和执行高通量药物筛选的一个组成部分。经典的细胞死亡检测方法包括流式细胞术，它需要大量处理细胞，只提供终点数据。相比之下，动力学成像是实时研究动态生物过程的关键应用。细胞死亡的动力学分析允许对细胞群内凋亡和坏死事件的积累进行敏感、实时的测定。

本文介绍了使用凋亡和坏死荧光探针结合自动动力学成像来定量评估多个细胞系中已知的细胞死亡诱导剂的影响。采用无标记高对比度亮场成像评估细胞总数和荧光探针同时量化质膜倒置暴露磷脂酰丝氨酸水平的早期凋亡和与坏死相关的质膜破裂。这允许测定在48小时的药物治疗中每个细胞群的凋亡和坏死的百分比。

材料和方法

细胞培养

HT-1080细胞在高级Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY)中培养，添加10%胎牛血清(Gibco)和1倍pennstrep -谷氨酰胺(Cellgro, Manassas, VA)。SKOV3细胞在含有10%胎牛血清(Gibco)和1倍pennstrep -谷氨酰胺(Cellgro)的McCoy’s 5a Medium Modified (Gibco)培养基中培养。细胞以每孔2000 (HT-1080)或4000 (SKOV3)细胞的密度被植入黑边透明底部96孔微板(Corning, Corning, NY)，并允许其粘附一夜。环境条件，包括温度(37°C)，气体(5% CO)₂)和湿度(90%)在使用安捷伦BioTek Biospa 8自动培养箱进行两天的培养期间保持。2022世界杯附加赛决赛

细胞死亡诱导和成分添加

用浓度为10000 ~ 2.44 nM的喜树碱或牡鹿孢素稀释剂和无化合物对照剂处理细胞可诱导细胞死亡。培养基中还含有凋亡动力学试剂盒(ab129817)的试剂，由Abcam (Cambridge, MA)捐赠。细胞凋亡极性敏感指标(pSIVA)以10 μ L/mL的浓度加入培养液中。将坏死指示剂丙啶碘(PI)以5µL/mL的浓度加入培养基中。

细胞成像

细胞培养板由安捷伦BioTek BioSpa 8转移到安捷伦BioTek Cytatio2022世界杯附加赛决赛n 5细胞成像多模式阅读器每两小时。在整个成像步骤中，Cytation 5的环境条件保持在37°C和5% CO2。在PI、GFP和亮场通道中以4倍的速度捕获图像。在每个时间点捕获两张高对比度的亮场图像，一张聚焦图像用于参考，另一张离焦图像用于细胞计数。简单地说，使用高对比度亮场套件将细胞聚焦。然后使用视图线轮廓工具绘制一条横过成像场的细胞和背景部分的线。然后，在观察线轮廓的同时降低焦距高度，以确定达到细胞和背景亮度之间最大对比度的焦距高度。然后输入这个值作为参考高对比度亮场图像的偏移量。^3.

图像分析

图像预处理用于获得最好的对比度增强，将每个细胞减少为单个亮点。为此，利用黑色背景和30 μ m滚动球对高对比度图像进行处理。这就产生了一个带有明亮斑点的黑暗图像。自动背景压平参数用于去除GFP和PI通道中的背景荧光。(图1A至1C)。然后设置对象屏蔽阈值以识别每个计数单元。通过对高对比度的亮场图像进行掩蔽，并扩展亮场掩模以捕获PI和GFP信号(图1G到1I)，对图像进行分析。计算二级掩模中的PI或GFP积分。图像预处理和分析设置详见表1。

图1．凋亡和坏死细胞的图像分析。用喜树碱处理HT-1080细胞，观察喜树碱对HT-1080细胞凋亡和坏死反应的影响。第一行(A-C)显示预处理过的高对比度亮场图像，以及处理后0 (A)、12 (B)和24 (C)小时的GFP和PI。下一行图像(D-F)显示了由预处理的高对比度亮场图像所描绘的每个细胞周围的主掩模。第G-I行显示了扩展的掩码，它捕获了更多的单元格区域，并包含了GFP和PI信号。第J-L行以蓝色突出显示的凋亡细胞。M-O行显示坏死细胞，以蓝色突出显示。

表1。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5微生物板阅读器和成像软件设置。在高对比度明亮场信道中生成元胞掩模的图像分析参数。主掩模被扩展到包含PI和GFP信号来确定积分。

为了确定哪些细胞为凋亡或坏死阳性，根据阴性对照孔设置一个阈值(图2)。该阈值设置为比阴性对照孔平均值的平均值高出2个标准差。每个时间点的总凋亡/坏死细胞的百分比使用数据缩减工具箱中的比率转换函数来确定。

图2。细胞凋亡和坏死切断的散点图。(A) GFP积分和(B)来自阴性对照孔的PI积分用于亚群体分析确定凋亡和坏死细胞的截止值。平均值加两个标准差作为确定阳性凋亡和坏死细胞的基础。

结果与讨论

细胞凋亡的一个特征是细胞表面标记物的表达，导致凋亡细胞的早期吞噬识别，允许吞噬作用对周围组织的损害最小。这是通过细胞脂双分子层中通常向内的磷脂酰丝氨酸(PS)移动到质膜外层的表达来实现的。PS外化是一种众所周知的吞噬细胞识别信号。本研究使用了一种可可逆结合于活性与凋亡极性敏感指标(pSIVA) PS的探针。坏死的一个显著特征是质膜的破裂，允许吸收膜不渗透的染料，如PI，从而表明坏死细胞的存在。pSIVA和PI共同作用于区分凋亡和坏死细胞死亡。

用喜树碱处理HT-1080细胞，观察喜树碱对HT-1080细胞凋亡和坏死反应的影响。喜树碱是一种拓扑异构酶抑制剂，对多种细胞系具有较高的细胞毒性。3 .喜树碱通过与DNA拓扑异构酶I切割复合体结合，抑制单链断裂，引起细胞凋亡随着时间的推移和剂量的增加，凋亡和坏死细胞的数量都有所增加(图3和图4)。

图3。喜树碱处理HT-1080细胞的图像。用2500 nM喜树碱处理HT-1080细胞，在时间0 (A) 12小时(B)和24小时(C)的4倍图像显示PI(红色，坏死)和pSIVA(绿色，凋亡)染色。细胞凋亡和坏死均随时间增加，这些结果表明GFP阳性的凋亡细胞和PI阳性的坏死细胞的百分比随时间增加。

图4。喜树碱处理的HT-1080细胞。细胞凋亡和坏死以剂量依赖性的方式增加，通过时间过程(a,B)和48小时的剂量反应(C,D)证实。

接下来，用喜树碱处理SKOV3细胞，以确定药物对SKOV3细胞凋亡和坏死反应的影响。与HT-1080细胞的结果类似，随着时间的推移和剂量的增加，凋亡和坏死细胞的数量都有所增加(图5)。然而，仔细观察两组图可以发现，尽管两种细胞的反应都依赖于时间和剂量，但其反应存在固有的差异。在HT-1080细胞中，凋亡和坏死都在24小时后不久达到峰值，而在SKOV3细胞中，凋亡和坏死在20小时后或多或少地稳步攀升，但在此之前几乎没有细胞死亡。这可能是由于已知SKOV3细胞对肿瘤坏死因子和几种细胞毒性药物具有耐药性这是一个很好的例子，说明了不同的刺激会以不同的方式影响不同的细胞类型。

采用staurosporine处理HT-1080细胞，观察药物对HT-1080细胞凋亡和坏死反应的影响。staaurosporine是一种有效的蛋白激酶抑制剂，可诱导多种细胞的凋亡。⁶总的来说，随着时间的推移和剂量的增加，凋亡和坏死细胞的数量都有所增加(图6)。然而，在最高剂量诱导坏死的情况下，在12小时有一个尖峰，然后随着与PI结合的核DNA从细胞中丢失并扩散出像平面，峰值下降。

最后，用斯陶罗孢素处理SKOV3细胞，观察药物对SKOV3细胞凋亡和坏死反应的影响。与之前的结果相似，随着时间的推移和剂量的增加，凋亡和坏死细胞的数量都有所增加(图7)。然而，与喜树碱对SKOV3细胞的反应相比，当暴露于鹿孢素时，整体的凋亡和坏死反应略大，突出了相同的细胞对不同刺激的反应不同的事实。

图5。喜树碱处理过的SKOV3细胞。细胞凋亡和坏死以剂量依赖性的方式增加，时间过程(a,B)和48小时的剂量反应(C,D)证明了这一点。

图6。staurosporine处理的HT-1080细胞。细胞凋亡和坏死以剂量依赖性的方式增加，这在时间过程(a、B)和16 (C)和12 (D)小时细胞死亡最高水平时的剂量反应中得到证明。

图7。staurosporine处理SKOV3细胞。细胞凋亡和坏死以剂量依赖性的方式增加，时间过程(a,B)和48小时的剂量反应(C,D)证明了这一点。

结论

使用凋亡和坏死荧光探针结合自动动力学成像，可以定量评估多个细胞系中已知的细胞死亡诱导剂的影响。该方法使用高对比无标记的亮场成像来检测细胞总数和同时标记凋亡和坏死细胞的细胞染料。这允许在不使用核染料的情况下，通过长期药物治疗，测定每个细胞群的凋亡和坏死百分比。当HT-1080或SKOV3细胞用喜树碱或匙孢素稀释处理时，随着时间的推移，细胞凋亡和坏死呈剂量依赖性。该实验还显示了不同细胞对相同刺激的不同反应，如SKOV3和HT-1080对喜树碱的反应不同。细胞死亡的动力学分析允许对细胞群内凋亡和坏死事件的积累进行敏感、实时的测定

参考文献

1. 细胞凋亡:程序性细胞死亡综述。毒理学杂志35,495-516(2007)。
2. 凋亡、焦亡和坏死:死亡和死亡真核细胞的机制描述。感染。Immun. 73, 1907-16(2005)。
3. 使用无标记细胞计数的动力学增殖试验。(2017)
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5. Morimoto H, Safrit, J. T. & Bonavida, B.肿瘤坏死因子- -和白喉毒素介导的人卵巢肿瘤敏感和耐药细胞株细胞毒性的协同作用。中华免疫学杂志(1991)。
6. Tamaoki, T.等。staaurosporine，磷脂/钙离子依赖性蛋白激酶的有效抑制剂。物化学。Biophys。第135、397-402号决议(1986)。