2020年12月10日,
作者: Wendy Goodrich，安捷伦科技公司
摘要
单纯疱疹病毒1和2 (HSV1/2)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)荧光标记单克隆抗体(maabs)对抗已知的巨细胞病毒(CMV)感染的成纤维细胞，以评估自动数字广角倒置显微镜系统的性能。直接荧光抗体分析(DFA)图像分析显示，HSV1/2和VZV单克隆抗体对CMV抗原无交叉反应性，特异性100%。区分阳性和阴性病毒染色最重要的参数是正确的滤镜设置、聚焦、曝光和背景压平设置。
简介
直接免疫荧光法(DFA)是一种用于识别病毒表面不同蛋白质的方法。间接免疫荧光(IFA)方法将荧光探针与抗原-抗体复合物结合需要两个步骤，而DFA方法将荧光标签直接偶联到一抗上，只需要一个结合步骤。偶联添加后，非结合抗体被洗去，目标抗原-抗体复合物的存在或缺失通过荧光显微镜可见(图1)。DFA的简单性使其成为确认病毒分离物培养、筛选样本作为初步疾病诊断的一部分以及监测治疗效果等应用的有用工具。本应用说明描述了自动显微镜在DFA分析工作流程中的使用，与非显微镜DFA分析相比。虽然DFA可以在IVD工作流中使用，但本应用注释中比较的方法并没有为IVD工作流提供协议。
虽然DFA有助于定性存在/缺失检测，但它也允许病毒内含物的视觉表征和量化，包括细胞内定位和对细胞形态的影响。此外，可以描述和排除可能干扰结果解释的检测伪影或污染物。在本案例研究中，一种自动图像捕获、处理和分析的数字广角显微镜应用于DFA。自动化显微镜趋向于简化工作流程，特别是在多个标本的情况下，并可以消除手工显微镜的用户可变性。
图1所示。(A)与间接免疫荧光相比，DFA只需要一个抗体结合步骤。(B)典型的DFA工作流程包括将荧光探针标记的针对病毒抗原的一抗与反染色一起添加到样本细胞中。清洗后，只有受感染的细胞保留抗体。然后对样本进行成像，以评估阳性或阴性结果。如果已知对特定病毒抗原呈阳性的对照样本用非特异性抗体处理，则结果应为阴性。
作为一种显微镜方法，DFA在很大程度上依赖于“荧光显微镜的性能对于获得满意的测试结果至关重要……目标、灯泡强度和瓦数以及过滤器可能会影响结果”(Millipore 2012年)。DFA普遍规定使用对照来验证试剂的功能，培养方法，显微镜设置和染色技术的用户熟练程度。当确证一种新的检测和分析仪器的性能时，特异性挑战是将测试结果与预期结果进行比较的一种方法(表1)。在这里所做的工作中，使用一个常见的IVD应用程序作为模型来演示直接免疫荧光的图像分析。针对HSV 1、2和VZV抗原的联合单克隆抗体被挑战到已知的CMV抗原阳性和阴性对照细胞单层，以评估自动数字宽视场倒置显微镜和图像分析系统进行DFA应用所需的配置和分析参数。
表1。确定已建立的方法和测试方法之间的一致性的一种常用方法是使用某种“真值”矩阵的格式来比较结果。诊断测试通常需要使用这种方法进行准确性测试。特异性和敏感性是准确性指标，指的是一种检测方法正确识别真阳性和真阴性的能力。根据该表，特异性百分比计算为[d/(b + d)] × 100，敏感性百分比计算为[a/(a+c)] × 100。具有100%特异性和100%敏感性的靶标表明，与已建立的方法相比，阴性和阳性样本的解释在所有情况下都是相关的。
DFA试验和挑战试验原理
在本次评估中使用的自动数字显微镜能够清楚地区分阳性和阴性对照，正确地识别交叉反应，并在可接受的特异性%范围内排除阴性结果，其能力是由检测用户手册中包含的检测和识别病毒染色模式的规范所指导的(见“材料和方法”)。
正如用户手册中所定义的，使用FITC过滤器组，直接早期抗原IE1和IE2 CMV ad169衍生蛋白的阳性染色表现为至少2个或更多完整细胞在细胞核中显示亮绿色荧光，HSV-1和HSV-2 155 kD主要衣壳蛋白阳性反应表现为至少2个或更多完整细胞在细胞质和/或细胞膜中显示亮绿色荧光。使用TRITC过滤器组，至少2个或更多完整的细胞在细胞核、细胞质和/或细胞膜上显示粉红色荧光，表明VZV立即早期抗原糖蛋白gp I阳性反应。如图8所示，还描述了其他定义形态学特征。HSV/VZV抗体与CMV抗原交叉反应的预期结果为阴性(<2个阳性细胞)。使用HSV/VZV DFA共轭，阴性结果被正确解释，相对于谓词方法的平均相对特异性为97%。特异性%最低为85.7%，95%可信区间为79.2% ~ 92.2%。
材料和方法
挑战试验
Millipore Light Diagnostics CMV DFA试剂盒(零件号3245)、CMV对照载片(零件号5027-5)、Simulfluor HSV/VZV DFA试剂盒(零件号3295)、HSV对照载片(零件号5093 -5)和水痘- zoster对照载片(零件号5088 -5)的测试程序按照试剂盒插入说明(图1)进行。CMV检测也进行了，但使用Simulfluor HSV/VZV试剂(零件号5235)代替CMV DFA试剂(零件号5090)。检测试剂盒和幻灯片附件都包括准备好的阳性和阴性对照(图2)。作为减少实验变量的一种方法，挑战检测被设计为优化，然后应用自动图像捕获、处理和分析解决方案到用户手册的测试程序、结果解释和限制部分，通过比较使用特异性抗体处理的对照孔和使用非特异性抗体挑战的对照孔的结果。
成像分析
使用Agilent BioTek Lionheart FX自动显微镜上的载片适配器(部件编号1220548)对载片盖滑块进行成像，该显微镜由Agilent BioTek 2022世界杯附加赛决赛Gen5 v3.04微板阅读器和使用GFP的成像软件控制(部件编号1225101 Ex: 469 Em: 525 LED cube 465部件编号1225001);Cy5(零件号1225105 Ex: 628 Em: 685 LED立方体623零件号1225005);和RFP(零件号1225103 Ex: 531 Em: 593 LED立方体523零件号1225003)滤波器组，以及一个20倍物镜(零件号1320517)，校正项圈设置为0.17。在各自的阳性对照孔上设置曝光(增益、集成和LED强度)，并用于同一试验的所有图像(图4)。细胞单层的聚焦高度使用Cy5检测埃文斯蓝反染色，并通过手动和软件中的激光自动聚焦功能确定，以适应不同的载片制备、细胞类型和安装介质应用。对每个样本自动进行5 × 4蒙太奇图像，以最大限度地获取统计数据点。用于掩盖分析反应和定义亚种群的信号和大小阈值被统一应用于同一分析物的所有图像。成像分析的原理如图3所示。详细的图像分析设置如表2所示。
图2。准备了阳性和阴性对照玻片。
图3。巨细胞病毒的成像分析原理。用GFP和Cy5滤镜分别捕获成纤维细胞中CMV(绿色)的20倍目标(红色)的多个图像，使用5 × 4蒙太奇方法将多个单独的图像拼接成一个更大的图像。
表2。用于图像分析的配置和设置。
1自动预处理，平滑指数为1。
2关闭downsize选项不会影响单元格计数，但会由于分辨率的差异而影响阈值设定。为了达到最佳效果，建议使用Agilent BioTek Gen5 v3.05，不减少图像大2022世界杯附加赛决赛小。
3.最终阳性计数仅包括完整细胞内定义为局部病毒包涵体的物体(以排除单个细胞内定义的传染性区域之外的物体)。GFP阈值计算为-1 STDev，取距离细胞核5 μm，半径为15 μm的所有物体的平均值作为CMV阴性对照。Cy5阈值由CMV阳性对照计算，定义为主掩码定义的阳性对象半径为7 μm范围内的平均值-2 STDev。
图4。。不正确的图像捕捉设置会导致对VZV DFA (A)结果的错误解读。使用阳性对照(PC)，对VZV (RFP滤镜组，橙色)和埃文斯蓝反染(Cy5滤镜组，亮红色)的焦距和最佳曝光设置显示。在应用默认背景校正设置后，RFP上的主要掩码定义将导致26个对象(边缘对象除外)的阳性着色计数。(B)使用Cy5的PC曝光设置，确定阴性对照(NC)细胞单层的焦距。RFP PC曝光设置应用在相同的焦距上。使用相同的PC背景校正和主掩码标准，没有检测到对象。(C)使用Cy5焦距作为基线，将自动曝光和自动对焦应用于NC(不同图像区域)上的RFP。PC曝光设置增加了2924 ms的整合时间(快门速度)，距离细胞单层10µm的焦距导致NC的假阳性计数为110。为了消除NC的虚假目标检测(数据未显示)，需要将RFP滚动球背景校正设置从68µm大幅降低到10µm，并将掩蔽信号阈值提高1.5倍。信号阈值的增加导致正计数为20，而PC为26。
结果与讨论
自动化显微镜和图像分析系统解释CMV、hsv /2和VZV的DFA所需的参数使用修改的、简化的特异性挑战进行评估。为了达到DFA的有效结果，需要仔细考虑显微镜组件和成像设置，如下所述:
正确的过滤器设置
几十年来，埃文斯蓝一直被用于DFA作为FITC和TRITC标记探针的反染色剂，主要用于抑制自身荧光。报道的埃文斯蓝荧光检测的激发峰不一致，包括470 nm, 540 nm和630 nm，很可能是由于底物的差异。在470 nm和540 nm的激发范围与FITC和TRITC探针相同。尽管FITC和TRITC滤波器集与埃文斯蓝的发射峰值不同，但在这些波长范围内发射出可检测到的但暗淡的埃文斯蓝染色——GFP检测到时为暗绿色(FITC，图5和8)，RFP (TRITC)检测到时为暗红色。Agilent BioTek Lionhear2022世界杯附加赛决赛t FX自动显微镜的灵敏度可以根据图像采集设置的定义来补偿暗沉染色。埃文斯蓝与这里使用的单克隆抗体探针的光谱重叠被发现有可能导致不正确的暴露设置和从信号背景中区分阳性病毒染色的困难，特别是在为FITC和TRITC过滤器集(分别为GFP和RFP过滤器集)定义阳性染色模式的VZV检测成像时。因此，在埃文斯蓝上进行光谱扫描，显示出明显的激发峰为630 nm，发射峰为680 nm(数据未显示)。从FITC和TRITC标记的单克隆抗体的光谱检测距离具有消除信号重叠和错误曝光设置的优点，这些可能导致结果的错误解释。Cy5滤波器组(Ex: 630;Em: 680)因此选择埃文斯蓝成像进行所有分析。 This had two advantages: (1) it increased the reliability of Evans blue detection to be used as an image analysis stain rather than just a visual contrast stain (Figure 7A), and (2) provided an anchor for determining optimal focal height of the cell monolayer, making correct exposure of viral staining more accurate. For confirmation of VZV, only RFP (TRITC) is required. Although GFP is shown as a contrast to RFP in Figures 5 and 8, Cy5 is still a better choice for imaging VZV counterstaining (Figure 4). Rather than a pink appearance when detected with RFP, VZV-positive cells appear bright orange regardless of contrast filter. This is due to the default colorization of the RFP filter set in the Agilent BioTek Gen5 image analysis software. Filter channels can be recolorized without effecting analysis results. For example, RFP and Cy5 both have high red color properties. Colorization of the RFP channel can be used to increase contrast with the Evans blue counterstain (Figure 9). Based on the work performed here, IVD immunoassays that use Evans blue as a counterstain should image the dye using a filter set defined for the Ex: 630 nm; Em: 680 nm spectral region.
图5．显示代表性阳性和阴性结果的图像表。注意，VZV染色是使用RFP滤波器集(TRITC光谱范围)确认的，感染细胞显示明亮的红橙色荧光，这是由于Agilent BioTek Gen5软件中图像通道的默认颜色属性。2022世界杯附加赛决赛埃文斯蓝检测在GFP成像时显示为暗绿色背景。由于埃文斯蓝与GFP和RFP都有光谱重叠范围，因此在使用FITC或TRITC探针识别病毒染色时，建议使用Cy5进行埃文斯蓝检测，如上图所示，对CMV、HSV1、HSV2和VZV进行病毒染色。
图6。阴性对照的非特异性染色(示CMV)。用户手册定义了预期的检测伪影，包括由于碎片内的结合物被捕获而产生的细胞碎片，一些细菌产生的蛋白A与单抗试剂的Fc部分结合，以及非特异性病毒分离物的潜在暗染。(A)这些人工制品的大小、形态和细胞定位可以使用初级和二级掩蔽和亚种群分析来定义。(B) 46.8%的被遮盖物体被识别为小(<2 μ m)，具有均匀的亮绿色染色和两个不同的球形图案，一个高度圆形(≥0.9)，另一个表现出均匀的低圆形(0.25)。这条曲线表明细菌污染和/或非特异性病毒分离物分别染色，“中”(≥2和≤10 μ m)和较大的物体可能代表共轭捕获。直方图和散点图允许定义阈值范围的方法，可用于从阳性病毒染色中区分或排除这些对象。只有一个物体在阳性染色的大小阈值内，没有一个物体满足完整细胞中病毒定位的亚种群标准(表2)，因此被解释为阴性(图7)。
图7。HSV1/2和VZV单克隆抗体对巨细胞病毒抗原的交叉反应性和相对特异性。(A)阳性细胞计数由完整细胞的初级掩码的总数和病毒定位阳性(由PC中的两个次级掩码和亚种群标准定义)来确认(表2)。获取的总图像样本的平均最终计数显示[n = 20]。CMV抗原阳性挑战单层细胞与HSV1/2_VZV单克隆抗体交叉反应阴性，这是由20张图像中每张图像阳性计数<2确定的。(B)通过比较HVS1/2_VZV单抗治疗的CMV确诊阳性和阴性对照与HVS1/2和HSV1/2_VZV单抗治疗的VZV阳性和阴性对照，确定相对特异性%。对于20个样本量，当HSV1/2_VZV单抗挑战时，阳性和阴性CMV对照细胞单层均为阴性，特异性为100%。单个阴性结果定义为每张图像<2个阳性计数，任何图像都没有阳性计数。由于这一挑战的修改性质(在已知的对照抗原上进行，而不是已知的阳性或阴性临床样本)，特异性%被认为是成像系统正确排除阴性结果能力的相对度量。
图8。镜检可以肉眼确认病毒表现，以补充定量结果报告。
图9。重新着色图像通道可以提高视觉对比度。(a)VZV阳性染色蒙太奇。使用RFP滤镜组检测VZV时显示为橙色，而使用Cy5滤镜组检测到的则是更亮的红色埃文斯蓝反染。(b)编辑RFP通道颜色属性为蓝绿色增加了阳性染色的视觉对比度。着色不影响用于图像分析的值。其他亮度和对比度设置也可用于增强图像质量而不影响结果。
最佳的图像捕捉和背景校正设置
如图4所示，正确的焦距、曝光和背景校正被证明对这些试验的成功成像至关重要。这些设置应该针对每个单独的检测和显微镜系统进行优化。为了减少或消除阳性和阴性染色之间的不确定结果，采用以下最佳做法:
- 用埃文斯蓝Cy5检测确定PC(抗原阳性)细胞单层的最佳焦距和曝光。
- 利用焦距高度，定义了病毒染色(GFP或RFP)的最佳暴露设置。
- 移到NC(抗原阴性)。
- 使用相同的PC曝光设置埃文斯蓝，确定细胞单层的最佳焦距。
- 使用这个焦距，使用PC曝光设置捕捉GFP和/或RFP。
鉴别和鉴别非特异性染色
这里执行的分析的用户手册建议查看nc以发现分析工件的存在。在被定义为阳性病毒染色的暴露和聚焦设置中仍可检测到的非特异性染色可以使用图像分析工具进行表征。该分析的结果可用于告知病毒对象的大小和信号截断，以确定阳性染色并将其与检测伪影区分开来。例如，定义为≥10 μ m的CMV病毒内含物的大小阈值将排除97%由图6所示的图像分析参数定义的非特异性伪影。可以定义其他分析，如图7所示，以增加基于单元内信号定位的剩余工件的排除。
阳性染色的扫描、计数和表征
通过在包含细胞染色的幻灯片上定义几何图形，可以更容易地在阳性和阴性对照细胞单层膜中找到感兴趣的区域。在Gen5中，这个几何图形可以被编程成一个板型定义，这样软件总是知道去哪里找到定义的血管区域的中心。从这一点，Cy5曝光和焦距，以及GFP或RFP曝光，可以优化细胞单层。使用较低的放大倍率物镜(例如4倍)和亮场成像，可以检测到图像区域的边缘。通过操纵杆或鼠标在血管周围移动，可以在图像区域内扫描幻灯片。通过切换到用于检测的过滤器集，在包含细胞染色的幻灯片上有一个定义的几何图形，可以更容易地在阳性和阴性对照细胞单层中找到感兴趣的区域。在Gen5中，这个几何图形可以被编程成一个板型定义，这样软件总是知道去哪里找到定义的血管区域的中心。从这一点，Cy5曝光和焦距，以及GFP或RFP曝光，可以优化细胞单层。使用较低的放大倍率物镜(例如4倍)和亮场成像，可以检测到图像区域的边缘。通过操纵杆或鼠标在血管周围移动，可以在图像区域内扫描幻灯片。 By switching to the filter set defined for detecting the cell monolayer, and using autoexposure and autofocus, regions of interest (ROI) can be precisely determined before moving to a higher magnification objective to define final focal and exposure settings. Applied montage settings from a starting ROI using the optimized capture parameters can then be defined to cover an area up to as large as the entire dimension of a standard coverslip. A 5 × 4 montage size is shown by Figure 3. The larger the montage, the larger the statistical pool for interpreting positive or negative results. Alternatively, a higher magnification (e.g. 40x) can be used for imaging. In that case, a larger montage would then be required to cover the same image area as that obtained for a 20x objective. To make automation easier, it is recommended that if samples are imaged using a slide and coverslip that they be mounted in the same region from sample to sample, either in the center of a microscopy slide, or offset to an area on the slide that match those of the assay control locations. This will allow a reference location that can be defined in a plate type definition so that subsequent assay ROI scanning begins at the same starting point for each new sample.
最终的病毒染色计数用于确定HSV1/2和VZV单抗对CMV抗原阳性和阴性细胞的交叉反应性和特异性结果，如图7所示。识别病毒染色的细胞计数分析参数的定义受以下因素的影响:(1)病毒包涵体的颗粒染色模式在整个细胞感染区域引起可变阈值;(2)细胞内病毒包涵体的大小和形状不一致;(3)排除非特异性物体染色。病毒对象识别使用初级掩码，有利于相对较大的对象和较低的荧光信号阈值，而不是阈值掩盖了单个细胞内多个明亮的、离散的病毒区域。这既能检测到更多完整的病毒包涵区域，又能排除非特异性的染色对象。可能需要更高的信号阈值来消除可能产生假阳性的背景干扰。这可能导致更少的，但仍然是特异性的真阳性计数(图4)。二级掩盖和亚种群分析也可以用于排除非特异性染色，或确认病毒定位，如果需要(图7A)。使用PC对阳性病毒染色进行表征后，应对为同一化验获得的所有样品图像应用相同的分析设置。阈值和亚种群值的优化和再验证过程可能需要微调掩膜，但对照的相同值应该一致，最终可以定义参考范围，并用于验证试剂的功能、培养方法、显微镜设置和用户对染色技术的熟练程度。
报告结果Gen5为每个图像通道自动计算选定的默认图像数据指标的数量。这些指标可用于定义可报告的附加参数，例如如图7B和8所示的病毒阳性对象计数。Gen5中的工具允许自定义报告图像数据，例如图8所示的注释功能。从Gen5，图像和图像数据可以保存和/或打印为。pdf或其他格式，并轻松导出到Excel，使结果可在多个平台之间传输。
在评估过程中，我们遇到了DFA的优点和局限性。对DFA的潜在增强是未来讨论的主题。
结论
Agilent BioTek Lionheart FX自动显微镜和Agilent Bio2022世界杯附加赛决赛Tek Gen5 Image Prime软件用于解释CMV、hsv /2和VZV的DFA所需的参数优化使用修改的、简化的特异性挑战进行评估。结果表明，采用表2所示的优化参数设置，HSV1、HSV2和VZV单克隆抗体对CMV抗原的相对特异性达到100%。除了正确的滤镜设置、曝光和焦距设置，图像分析工具(如亚种群分析)可以识别和排除非特异性染色，分离和计数阳性病毒染色，进一步实现了讨论部分中所述的性能。辅助功能，如扫描感兴趣的区域，图像捕获过程中的蒙太奇和拼接，以及图像结果的注释和报告，被发现对增加分析的目标区域和分别注释和报告病毒形态特征有用。参考文献
- 红雀,K.et。量化诊断测试或标记的准确性，美国临床化学协会，临床化学2012,58,9,1292-1301。
- Millipore Light Diagnostics SimulFluor HSV/VZV DFA Kit用户手册，2012年8月修订版A;3295人
- Millipore Light Diagnostics CMV DFA Kit用户手册，2012年7月修订版A;3245人
确认
图1A由hold提供，P.， 2015年7月28日，荧光显微镜样品制备:介绍-更好的固定样品成像结果的概念和提示(图4)，BioTek Instruments, Inc.。