二六年八月二十九日
作者: Paul Held博士和Wendy Goodrich Agilent Technologies, Inc.
简介
生物活性胺是由生物过程在所有生物体中形成的低分子量有机碱。其中一种生物活性胺是组胺。葡萄酒，尤其是红酒，是一种含有大量组胺的饮料。尽管已知红酒中有许多引起头痛的物质(如乙醇)，但组胺被认为是一些人在饮用红酒后出现剧烈头痛和偏头痛的主要原因。组胺是一种可产生的生物活性胺在活的有机体内或从饮食来源摄取。内源性组胺的产生是氨基酸组氨酸酶解羧的结果，由l -组氨酸脱羧酶催化(图1)。一旦形成，该化合物要么储存起来，要么在组胺- n -甲基转移酶和二胺氧化酶的作用下迅速失活。大部分组织组织胺存在于嗜碱性白细胞肥大细胞的变色颗粒中。其他含有组胺的组织包括大脑，它作为神经递质和胃的肠染色质细胞。在I型过敏过程中，肥大细胞和嗜碱性细胞由于抗原与细胞表面的IgE结合而释放出组胺，导致典型的过敏反应。在摄入组胺的情况下，许多相同的症状可以出现，但没有真正的IgE过敏反应发生。这种现象被称为“食物不耐受”，“食物过敏”一词用于真正的免疫反应。
图1所示。组胺通过酶催化组氨酸的脱羧而形成组胺。
皮疹、腹泻、恶心呕吐、头痛和哮喘是由组胺水平升高引起的食物不耐受的临床特征。这种反应的程度与摄入的组胺量直接相关，并且会因缺乏二胺氧化酶而加剧。除了食物不耐受外，组胺过高引起的中毒反应也存在。这些有毒水平的组胺通常是细菌降解富含蛋白质的食物的结果。这对许多鱼类来说尤其如此。许多鱼种的组胺含量是由鱼皮上的细菌降解的结果。死后，这些细菌将游离的组氨酸转化为组胺。因此，高水平的组胺被认为是分解的早期迹象。
测定葡萄酒样品中组胺含量的分析技术多种多样，主要是气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法。这些方法通常需要几个准备步骤将组胺转化为可检测的部分。此外，这些方法往往是时间和试剂消耗，导致在仪器和试剂方面的相当大的费用，并阻碍了对大量样品的测量。使用安捷伦BioTek ELx50微板洗条机和安捷伦BioTek ELx800吸光度微板读取器，可以方便地对许多样品进行ELISA检测。2022世界杯附加赛决赛
测试的基础是抗原-抗体反应。孔上涂有针对n -酰基组胺的特异性抗体。样品制备后，样品和标准品中的组胺衍生为n -酰基组胺。分别加入酰化组胺标准品和溶液样品以及酶标记的n -酰化组胺(酶偶联物)。游离组胺和酶标记组胺争夺抗体结合位点。任何未结合的酶结合物然后通过洗涤步骤去除。将酶底物(过氧化脲)和显色剂(四甲基联苯胺)加入孔中孵育。结合酶共轭将无色的显色原转化为蓝色的产物。加入停止试剂(硫酸)会使颜色由蓝色变为黄色。在450 nm(可选参考波长≥600 nm)下用光度法测量显色效果。 The resulting absorbance values are inversely proportional to the histamine concentration of the sample (Figure 2).
图2。竞争性酶免疫分析法。游离的n -酰基组胺和酶偶联的n -酰基组胺竞争特定的抗体结合位点。由于显色与捕获的共轭物量直接相关，而游离的结合物和共轭的n -酰基-组胺直接竞争结合，因此显色与样品的组胺浓度间接成正比。
方法
Ridascreen组胺(部件号1604)试剂盒购自R-Biopharm (Darmstadt, Germany)。每个试剂盒包含所有必要的成分，包括未包覆的酰基化板、标准物、试剂和包覆的检测板，可进行48次检测。测试过程是根据试剂盒说明进行的。简单地说，样品和标准品首先用100µL的样品或对照物与试剂盒中提供的25µL的酰化试剂和200µL的酰化缓冲液反应酰化。反应在室温下孵育15分钟，之后样品或标准品就可以进行测定了。使用试剂盒自带的抗体包被板，将样品和标准品的25 L等量的样品移液到微板的孔中。每孔取抗组胺捕获抗体100µL，室温孵育40分钟。孵育后，用ELx50型微板条形清洗机以250 μ L的洗涤液洗涤3次。
洗涤后，加入100µL的共轭物，室温孵育20分钟。再次用ELx50洗衣机以250µL的洗涤缓冲液循环3次，然后加入100µL的底物/发色剂混合物。让颜色在室温下，黑暗中发展15分钟。加入100 μ L的酸止液后停止反应，用ELx800吸光度微板读取器测定每孔在450 nm (630 nm参考波长)处的吸光度。对所有的样品和标准，计算样品或标准与零标准均值(B/Bo)的比值。然后使用标准的B/Bo计算生成标准曲线。
实验1
第一个实验设置了三套不同的试剂盒标准的副本。除试剂盒提供的标准外，还对试剂盒提供的阴性对照6个重复和阳性对照6个重复进行检测。分析内重复性实验涉及使用不同试剂盒的标准曲线的多次运行。在每种情况下，使用4参数逻辑拟合生成标准曲线来描述数据。为了进行比较，多次实验重复了试剂盒标准的测试，以及许多白葡萄酒和白仙粉黛样品重复运行。
结果与讨论
这些数据表明，R-Biopharm试剂盒与ELx800吸光度微板阅读器和ELx50微板洗条机一起，可以用于定量葡萄酒样品中的组胺。与任何竞争的ELISA反应一样，分析物浓度的增加导致吸光度的降低(图3)。不同样品的重复标准曲线导致曲线在形状和参数上非常相似。
图3．典型的标准曲线。使用Agilent BioTek Gen5数据分析软件叠加三条不同的标准曲线，并绘制在同一组轴上。2022世界杯附加赛决赛每个数据点代表特定标准曲线的重复确定的平均值。
当个体样品在不同已知浓度的组胺进行比较时，观察到非常好的测定间重复性。在15、5和1.5 ppb处的样品跨越了标准曲线的大部分动态范围。对于每一种浓度，当在同一个微板上测量时，单个样品返回非常相似的计算浓度(图4)。尽管在不同时间(测定内重复性)测量相似的样品显示变异性增加，但不同样品之间仍有非常好的一致性(图5)。
图4。Inter-assay可重复性。将三种不同浓度的样品重复多次，分别在同一微板上进行分析。每个样品的吸光度值被用来插值一个标准曲线。计算得到的浓度通过Agilent BioTek Gen5的Power Export功能导出到Microsoft Excel中并绘图。2022世界杯附加赛决赛
酶联免疫吸附试验试剂盒对酰化组胺非常特异。如表1所示，所使用的抗体在检测时仅对密切相关的化合物n -甲基组胺具有少量交叉反应性。其他被检测的化合物被发现低于检测限度。
表1。R-Biopharm特异性测定ELISA **
图5．Intra-assay可重复性。每个样品在三个不同的检测板上重复运行。个体结果通过Agilent BioTek Gen5的Power Export功能导出到Microsoft Excel并绘制。2022世界杯附加赛决赛注意，每种颜色表示三个不同的实验板。
当对两种不同的葡萄酒进行组胺测定时，观察到不同样品之间非常一致。两种样品在450nm处吸光度值的cv都小于5%(表2)。这些葡萄酒样品中组胺水平较低，导致吸光度值位于标准曲线上相对不变的部分。这表现为计算浓度的较大变化和相对较小的吸光度偏差，导致对样品浓度观察到较高的cv。
表2。葡萄酒样品测量。
组胺被认为是一种过敏原和头痛的诱因。红酒和白葡萄酒的平均组胺含量分别为5.7 ppm和3.4 ppm，极低的组胺含量是一个可取的特征。检测试剂盒的检测限被认为是含有组胺的最低标准(即0.5 ppb)。因为葡萄酒样品被稀释为1:50 00，因此葡萄酒样品的最低检测限度是250 ppb。这远远低于葡萄酒的典型浓度范围，通常是低ppm范围。这一巨大的灵敏度裕度意味着该测定方法可用于监测发酵过程中乳酸菌对组胺的脱羧过程中组胺的形成。
生物活性胺的研究有许多有趣的原因。摄入外源性组胺有一定的“风险”，尤其是高水平的组胺。从责任的角度来看，防止接触高水平的葡萄酒产品当然是重要的。乐鱼平台入口此外，高胺含量与所用葡萄的质量以及葡萄酒酿造过程中普遍存在的卫生或卫生条件之间可能存在关系。1早在1978年就有报道称，对葡萄酒中生物胺含量的常规检测是检测生产工艺缺陷的一种手段。2此外，未来可能会对葡萄酒中的生物活性胺含量进行监管，如对鱼类的监管。一些国家已经规定了葡萄酒中组胺的限量。瑞士推荐10 mg/L，德国推荐2 mg/L，比利时推荐5 mg/L，法国推荐8 mg/mL。3.
参考文献
- 维达-卡鲁，M.C.等人(1990):在酿酒过程中，ish葡萄酒中的组胺和酪胺的形成。点。j .烯醇。Vitic 41:160 - 167。
- Battaglia, R.和Frolich, D.(1978)用高效液相色谱法测定葡萄酒中的组胺。J.高分辨率。Chromatogr。
- s.c. Souza, Theodoro, K.H, Souza, E.R, daMotta, S, Beatriz, M, Gloria, A，(2005)巴西葡萄酒中的生物活性胺:类型，水平，以及与理化参数的相关性。巴西生物与技术档案第48卷。