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苏木精和伊红染色组织

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2014年10月31日

利用彩色亮场成像与细胞5成像固定和染色组织


作者: Paul Held博士,安捷伦科技有限公司

摘要

标记固定细胞和染色细胞的成像和分析传统上是使用多目标分期显微镜手动检查显微镜载玻片来完成的。随着数字彩色亮场成像的出现,样品可以自动成像,数据存储检查独立于显微镜。本应用说明描述了安捷伦BioTek的使用2022世界杯附加赛决赛2022世界杯南美区预选赛 ,一种低成本高价值的组合细胞成像仪和微孔板阅读器,快速成像苏木精和伊红染色的组织载玻片。

简介

近一个世纪以来,染色组织的检查一直是临床诊断病理学和癌症研究的标志。在载玻片上固定和染色组织已成为常规的数据存储方法。病理标本常规固定,石蜡包埋长期保存。然后将石蜡样品制成薄片,固定在载玻片上,脱蜡,随后通常用苏木精和伊红染色,并用盖片密封。病理切片检查要求检查者使用分阶段多目标显微镜进行观察。检查后,常规将载玻片与石蜡包埋组织一起存档,以备再次检查。如果需要复查,则必须取出载玻片或重新处理石蜡固定组织,并在复查前制作新的载玻片。随着数字成像和数据存储技术的进步,彩色图像越来越受欢迎。

苏木精和伊红染色正常人小肠组织。

图1所示。.苏木精和伊红染色的正常人小肠组织。

1876年,化学家Wissowzky首次将苏木精和伊红(H&E)染料组合用于组织染色。1苏木精,或者更准确地说是其氧化形式的血红素,与媒染剂(通常是Al3+)结合,以染色细胞物质中的DNA。它被认为与构成DNA主干的负电荷磷酸基结合,然后经历复杂的配位或偶联,成为细胞核的永久染色剂。与Al3+媒染剂一起,染料在中性到碱性条件下产生蓝色(图2)。

苏木素(血红素)在细胞内与DNA结合

图2。苏木精(血红素)在细胞核内与DNA结合。

相反,阴离子伊红Y会与蛋白质上的带正电荷的基团结合,比如氨基。例如,赖氨酸残基具有pKa在10范围内的ε-氨基,因此它们在整个染色过程中都保持正离子状态(图3)。

双离子结构,伊红Y用于H&E染色。

图3。双离子结构,伊红Y用于H&E染色。

虽然已经开发了其他染色细胞和组织切片的染色方法和方案,但大约140年前开发的原始方法仍然相对不变。苏木精甚至不是人工合成的,而是从原木中提取的。即便如此,H&E染色仍然是组织学应用中最常见的染色方案。

本应用笔记演示了自动化数码显微镜用于h&e染色组织切片成像的实用性。通过软件控制选择2.5至60倍的显微镜物镜,可以实现低至高的切片放大倍率。对焦和曝光设置都是自动的,操作简单。实时图像可以在计算机显示器上查看,所需的图像可以保存和下载为许多不同的数据文件,包括TIF和PNG,简化了数据共享。

材料与方法

商业上可以买到的正常人体肠道和肾脏的固定和染色组织切片,以及慢性肾炎患者的肾脏组织切片都是从Konus购买的。使用Agilent BioTek Cytation 5细2022世界杯附加赛决赛胞成像仪对载玻片进行成像。Agilent BioTek Gen5+软件将蒙太奇间距重叠设置为默认拼接。2022世界杯附加赛决赛一系列彩色亮场图像蒙太奇(12 × 8)和单个图像瓦片使用线性混合沿着每个图像瓦片的重叠部分缝合。使用红色通道进行注册,生成的文件减小到最大大小的25%。

结果与讨论

Cytation 5对固定的亮场图像和h&e染色组织切片的着色能力如图4所示,其中正常肾脏和病变肾脏进行了比较。使用60倍物镜,捕捉和记录幻灯片的蒙太奇图像,并将单个图像块拼接成每个幻灯片的单个连续图像文件。显著的苏木精蓝染色显示间质间隙有淋巴细胞浸润。鲍曼囊无定形粉红色伊红染色显示肾小球透明化。正常肾组织肾小球可见开阔的弓曼氏腔,无炎症细胞。

正常肾与病变肾的比较。

图4。正常肾与病变肾的比较。(A)正常肾脏和(B)慢性肾炎肾脏的苏木素和伊红染色组织。图像代表了用60倍物镜缝制的12 × 8蒙太奇。比例尺代表200µm。

蒙太奇阵列允许捕获比单个图像帧更大的区域。通过将图像彼此分离,可以使用数组从幻灯片的不同区域获得单独的瓦片。每一项都将分别进行检查和分析。或者,通过轻微重叠,可以将离散图像组合在一起,以创建一个更大的连续组合。随着放大倍数的增加,可以获得更多的信息,尽管是在一个小得多的区域上。检查的滑动面积取决于所使用的放大倍数。Cytation 5可以放大载玻片区域的程度如图5所示,其中使用2.5倍和60倍物镜对人体肠壁组织切片进行蒙太奇成像。2.5倍物镜蒙太奇将整个组织切片描绘为总图像的一小部分。圆盖卡瓦的边缘也可以分辨出来。切片成像的区域被描绘在Gen5软件提供的切片图形上。 The 60x objective montage is a very small subsection of the 2.5x image. The location of this image in context with the entire tissue slice is indicated, along with the much smaller region of the slide.

使用Cytation 5成像微孔板阅读器的最大放大倍率。

图5。使用安捷伦BioTek Cytation 5细胞成像多模式阅读2022世界杯附加赛决赛器的最大放大倍率。将固定染色的人体肠壁组织切片固定在1 " × 3 "载玻片上,用2.5倍和60倍物镜成像,生成12 × 8蒙太奇。蒙太奇瓷砖然后缝合使用线性混合方法与登记的红色通道。后续图像文件减少到最大的25%。用60倍物镜放大的2.5倍图像显示的组织面积,以及用每个蒙太奇和幻灯片示意图显示的切片面积。

图6展示了Cytation 5的多目标炮塔系统的便利性。在没有干预的情况下,使用6种不同放大倍率(2.5倍至60倍)的彩色亮场蒙太奇(12 × 8)对患病人体肾脏组织进行相同的固定和染色切片成像。下一个更高放大倍率成像的区域被识别为每个图像。由于Cytation 5采用6位转塔系统,可以为滑动区域编程不同的放大步骤,以自动定位、对焦和成像,无需任何用户干预。如图5所示,低倍率图像可以在低分辨率下观察到整个组织切片。随着放大倍数的增加,微观细节的分辨率也随之提高。在查看结果后,可以选择用于演示目的的最佳放大倍率。

人类慢性肾病肾组织的宏观和微观结构。

图6。人类慢性肾病肾组织的宏观和微观结构。在不断放大的情况下记录一系列蒙太奇(12 x 8)图像,并从同一组织切片中缝合。框内区域表示下一放大倍率图像中成像的区域。每个蒙太奇都有客观放大和比例尺。

Cytation 5细胞成像多模式阅读器,结合Gen5软件,有几个功能,有助于染色组织切片的自动化成像。幻灯片既可以手动成像,也可以使用自动例程。手动成像允许研究人员在读取器内使用Gen5的软件控制或外部操纵杆手动操作载体。一旦确定了感兴趣的区域,就可以捕获和保存单张或蒙太奇彩色亮场图像,并在Gen5手动模式软件字段中对图像进行缝合和分析。或者,可以使用自动例程读取幻灯片。可以在成像之前对幻灯片位置、放大物镜和蒙太奇阵列(最高15 × 15矩阵)进行编程。可以使用多个读取步骤来定义同一实验中要成像的不同目标和/或幻灯片的不同区域。

彩色亮场的一个重要属性是白平衡。白平衡是去除不需要的颜色转换的过程,使白色的物体在图像中呈现为白色。正确的平衡需要考虑颜色“温度”或光源的相对冷暖度。人眼比数字传感器更擅长在各种光线条件下判断白色,因此在彩色亮场成像过程中自动平衡以实现正确的颜色再现是很重要的。色彩平衡是通过测量和调整三个颜色明场通道的输出独立于实际样本,以确保它们是等效的。这个过程是由Gen5对每组三色图像自动完成的。一旦执行了白平衡,在读取步骤中,照明水平是固定的且不变的。

低倍率物镜,如2.5倍和4倍,具有较长的景深。当这些物镜用于彩色亮场成像蒙太奇时,Cytation 5将只在第一张图像之前使用自动对焦,节省大量的大蒙太奇时间。更高的放大倍率物镜,具有更短的景深,需要对每张图像进行自动对焦,因为载玻片平面度或标本厚度的微小偏差可能导致图像失焦。当手动成像标本时,用户将随着成像仪的每一次移动而自然地调整焦点。相反,在无人值守的操作下,仪器需要能够在没有干预的情况下调整焦点,以获得进一步分析所需的良好图像。荧光显微镜和彩色亮场显微镜的自动聚焦过程是不同的。

基于荧光的自动聚焦使用基于图像的统计算法,通过测量标准偏差和/或相邻像素之间的相关性来评估对比度,以确定最佳焦点。2当仪器接近焦点时,真实图像与背景像素之间的信号差值急剧增大,因此所有像素的标准差增大。像素标准差与z轴高度的关系图在焦点处产生一个尖峰使用统计算法(如标准偏差)的优点是特征的宽度。图像的对比度在远离焦点的地方开始增加,从而产生一个更大的范围,在这个范围内,搜索结果可以成功地找到最佳峰值对比度。3,4

结论

虽然荧光成像在背景和图像之间有非常明显的差异,但彩色亮场自动对焦在自动对焦中提出了独特的挑战。Brightfield成像具有相当低的整体对比度,以及较不明确的目标边缘和来自反射、半月板和厚样本的多个焦平面。使用彩色明场成像,当样本厚度超过景深时,对Z轴物镜高度的标准偏差进行扫描,就会发现一个双峰,这对于10倍或更大的物镜是常见的。为了保证图像的均匀,需要选择相同的峰值。Agil2022世界杯附加赛决赛ent BioTek Cytation 5细胞成像多模式阅读器使用“双峰”算法来选择右手高z轴峰值的更高焦平面。简单地说,扫描是使用对比或边缘检测来执行的。计算扫描的导数,选取两峰间槽对应的过零点。该算法现在寻找零点交叉右侧的峰值“边缘检测”值。然后在边缘检测计算的较高z轴最大值处拍摄图像。这个过程确保相同的焦点总是用于后续图像,使焦点锐利和可重复。

参考文献

  1. 维索维茨基,A. Ueber das Eosin als reagenz auf Hämoglobin und die Bildung von Blutgefässen und Blutkörperchen bei Säugetier und Hühnerembryonen。档案für mikroskopische解剖1876;13日,479 - 496。
  2. 太阳,y;Duthaler,美国;计算机显微镜中的自动聚焦:选择最佳聚焦算法。Microsc。决议技术,2004,65,139-149。
  3. Groen f;杨,i.t.;自动聚焦算法中使用的不同聚焦函数的比较。细胞计数技术1998,6,81-91。
  4. 杨、t;Jayasooriah, R.组织显微镜自动聚焦。图像与计算,1993,11,629 - 639。
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