使用新颖的MultiFlo FX附件进行球形培养的自动媒体交换

作者:Brad Larson，安捷伦科技公司

摘要

由于具有模拟能力，三维球形细胞模型已成为生命科学研究的支柱在活的有机体内——环境。在细胞排斥微板中使用球状体进行介质交换和清洗可能会有问题，因为有意外去除球状体的风险。通过结合一种新型蠕动泵工具，这些过程可以以可控的方式进行，消除了球体的破坏和移除，实现了需要多种介质交换的长期3D实验过程。

简介

球形三维细胞结构是许多研究领域的支柱，包括肿瘤学和毒理学¹．3D培养细胞提供了更多在活的有机体内类似环境，使细胞在培养较长时间后保持高活力。为了保持未处理细胞内的最高活力水平，并确保观察到的效应仅来自于处理，在整个实验过程中，培养基交换和重新给药是必要的，特别是在体外测试持续数周。与细胞模型的媒体交换不依赖于实验室软件，如果手工执行，即使是在单个盘子上执行，也会令人望而生畏。多通道移液器必须以极慢的速度移除和分配介质，并且必须小心保持移液器尖端远离实际的球体。

通过在安捷伦BioTek MultiFlo FX多模分配器上集成AMX自动介质交换模块，消除了意外从井中移除球体的风险。2022世界杯附加赛决赛用过的培养基被自动清除，只替换为新鲜培养基，或含有处理浓度的新鲜培养基。

材料和方法

材料

细胞

U-87胶质母细胞瘤细胞由Sachin Katyal博士(马尼托巴大学，温尼伯，马尼托巴，加拿大)慷慨捐赠。HT- 1080纤维肉瘤细胞(目录编号;CCL-121)和PANC-1癌细胞(目录号;CRL- 1469)从ATCC (Manassas, VA)获得。

实验组件

已知的拓扑异构酶I抑制剂喜树碱(目录编号208925)购买于EMD Millipore (Billerica, MA)。DMEM、低葡萄糖、丙酮酸、HEPES(目录号12320-032)、高级DMEM(目录号12491-015)、胎牛血清、10%(目录号10437-036)、青霉素-链霉素(10,000 U/ml)(目录号15140-122)和青霉素-谷氨酰胺(100x)(目录号10378-016)采购自ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)。

微型板块耗材

96孔，细胞驱避，聚苯乙烯，圆底，透明，无菌，带盖子的微板(目录编号650979)和384孔，细胞驱避，聚苯乙烯，圆底，透明，带盖子的无菌微板(目录编号787979)由Greiner Bio- One (Monroe, NC)捐赠。96孔透明圆底无菌超低附着微板带盖子(目录编号7007)和384孔黑色/透明圆底无菌超低附着微板带盖子(目录编号3830)由康宁公司(Corning, NY)捐赠。PrimeSurface®96U透明圆底96孔微板(目录编号;MS-9096UZ)和PrimeSurface 384U透明圆底384孔微板(目录编号:MS-9384UZ)是由S-BIO (Hudson, NH)捐赠的。

仪表

2022世界杯南美区预选赛

Cytation 5是一种模块化的多模式微板阅读器，与自动数字显微镜相结合。基于滤镜和单色仪的微板读数可用，显微镜模块提供高达60倍放大的荧光，亮场，彩色亮场和相位对比。该仪器可以在一个步骤中进行多达四个通道的荧光成像。特别强调活细胞测定，Cytation 5具有震动，温度控制到65℃，CO₂/ O₂气体控制和双喷射器用于动力学分析，并由集成控制Gen5Microplate Reader and Imager Software，它还可以自动捕获图像，分析和处理。该仪器用于在潜伏期动态监测3D类肿瘤活性。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek MultiFlo FX多模式分配器

MultiFlo FX是一个模块化的，可升级的试剂分配器，可以有多达两个周围泵(8管分配器)，两个注射器泵分配器和一个条状垫圈。注射器和垫圈歧管可以配置为板密度从6- 384孔。MultiFlo FX配备了AMX媒体交换模块。球体培养的介质交换是通过使用BioTek正在申请专利的AMX介质交换模块来完成的，该模块由两个独特的、改进的蠕动泵盒组成，带有8个不锈钢吸管(图1，右箭头)和分配器(图1，左箭头)头。盒式管是通过蠕动泵的MultiFlo FX和进入媒体瓶或管。软件允许泵缓慢而轻柔地运行，以便在抽吸或分配过程中不干扰球体。每个盒是完全高压灭菌，使无菌处理。

图1所示。AMX介质交换模块，具有独立的不锈钢管吸气(右箭头)和分配器(左箭头)头。

方法

细胞制备和类肿瘤形成

收集制备好的U-87、HT-1080或pan -1细胞，在完全培养基中稀释后，分别以100 μL(96孔微板)和50 μL(384孔微板)的体积分配到所有微板孔中。将1000个细胞分配到每个测试球体板的所有孔中。微板在37ºC/5% CO中培养₂48小时让细胞聚集成单一的球状体。

媒体交换方法

AMX介质交换模块的吸出端位于96井和384井格式的每口井的后面和右上角，管的底部从每口井的底部抬高，以避免干扰球体(图2)。使用缓慢的吸出速度从每口井中移出介质;96口板井介质残量为15 ~ 20 μL, 384口板井介质残量为10 ~ 15 μL。在向96孔球体板中分配新鲜介质时，分配管位于孔的后右角，远离球体;然而，当分配到384孔板时，管被直接定位在球体的上方，以防止中断。在两种微板井密度中，分配管的底部都从井底抬高，使介质液滴接触现有的井液，以确保相等的体积分配到每口井(图3)。介质分配速率经过优化，球体不会从每口井中心偏移。

图2。(a)AMX媒体交换模块吸气尖端定位;用(b) 96孔板在残留介质中描绘完整的球体;和(c) 384孔板。

图3。AMX媒体交换模块96孔板分配尖端定位。

AMX媒体交换模块的定性验证

U-87球体形成后，96孔和384孔球体微板被转移到带有AMX模块的MultiFlo FX上，同时进行5次介质交换循环，以模拟严格的清洗协议。一旦介质交换完成，微板被转移到cyation 5进行所有井的亮场成像。4倍物镜用于所有图像捕获。由于384井微板的井底呈锥形，在每张图像的外缘都可以看到一个黑色的环(图4B)。

AMX媒体交换模块的定量验证

喜树碱在培养基中稀释，建立8点滴定法(10 μM - 2.4 nM)，包括阴性对照，不含化合物。聚合后，96孔Greiner微板含有U-87球状体，96孔Corning微板含有HT-1080球状体，384孔S-Bio微板含有pan -1球状体分别放入BioSpa 8自动化的孵化器。每隔一定时间，培养皿自动转移到MultiFlo FX中，使用抽吸盒去除培养液，并使用分配盒更换不同浓度的抑制剂。在每次有剂量的介质交换后，平板被转移到cyation 5进行动态明亮场成像，以监测球体的生长。使用4倍物镜在z-堆栈中捕获多个图像，以确保精确计算球体体积。“对象大小”值，即球体的平均直径，使用球体公式的数学体积被合并到自定义Gen5度量中。

球体体积= (4/3)* π *(物体大小/2)^3.

这个过程在一个或两个星期的球形增殖潜伏期内重复进行。

结果

AMX媒体交换模块的定性验证

经过5个85%的介质交换循环后，96孔和384孔微板的亮场成像(图4)证实，在自动抽吸和分配步骤中，球状体没有受到干扰。

图4。(a) 96孔和(b) 384孔Greiner球形微板的Brightfield图像，经过5次介质交换。康宁和S-Bio微板的图像未显示。

AMX媒体交换模块的定量验证

在球形增殖抑制剂给药期间，利用Cytation 5动态捕获z-叠加亮场图像。然后使用Gen5™Microplate Reader和Imager软件自动计算球体体积。

图5．使用AMX介质交换的自动动力学球形增殖结果。计算长期暴露于不同浓度喜树碱下的球形体积。(a)Greiner 96孔球体板中的U-87胶质母细胞瘤球体;(b)康宁96井球体板HT-1080球体;(c)384孔球体板中的pan -1球体。

图5展示了在适当的实验误差下的预期结果，在所有的细胞模型和微板密度中，球形体随着时间的推移继续传播和体积增加。此外，毒素喜树碱相应地干扰球形繁殖。

结论

MultiFlo FX与AMX媒体交换模块有效地执行单媒体和多媒体交换，而不干扰96井和384井格式的独立3D球体。当与BioTek自动化结合时，介质交换工具为长期3D实验过程提供了一种快速解决方案。

参考文献

1.骑士,大肠;3D细胞培养技术的进展使组织样结构得以创建在体外．中国生物医学杂志，2015,27(6):746-756。

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