利用R-GECO生物传感器自动成像分析Ca2+通量

作者: Joe Clayton博士，Peter Banks博士，安捷伦科技公司

摘要

用Ca动态监测GPCR激活^{2 +}与人毒蕈碱M1受体一起转染HEK 293细胞的生物传感器。快速Ca^{2 +}在卡巴醇刺激下，通量明显，注射后1秒达到峰值，随后在90秒内衰减到基线荧光。成像还允许监测细胞群中的单细胞在视场动力学的差异可以评估。使用% Responders读数(对卡巴醇刺激有反应的细胞百分比)获得了合适的检测性能，该读数提供了z′值高于0.5和一致的药理学。

简介

G蛋白偶联受体(GPCR)激活后细胞内钙储存的动员对于细胞响应细胞间和环境信号至关重要。在人类中发现了超过800种GPCRs，每种GPCRs都具有一个共同的结构，即外部n端通过7个跨膜段连接到内部c端。¹配体在n端结合导致受体的构象变化，从而引发信号级联。gpcr介导的途径是药物发现工作的主要焦点，特别是在癌症治疗方面。²

激活GPCRs的信号分子和受体激活的功能后果是不同的。信号分子与GPCR结合激活相关的三聚体gtp结合蛋白(G蛋白)。G蛋白由α-亚基和β-和γ-亚基复合体组成，α-亚基与鸟嘌呤核苷酸结合，激活时将GTP水解为GDP。每个G蛋白亚基的不同亚型可以结合在一起实现不同的功能输出。α-亚基Gs和Gq亚家族的激活触发细胞内钙储存释放到细胞质中，通过调节钙依赖蛋白传播信号。^3.

Montana Molecular提供一系列荧光生物传感器用于研究GPCR激活。使用BacMam传递将生物传感器转染到活细胞中，直接将病毒颗粒添加到细胞中，然后在微板中播种，从而提供简单的检测准备。该生物传感器机制是基于循环排列的荧光蛋白，结合到特定的第二信使。红色荧光，基因编码Ca^{2 +}指示物(R-GECO)的荧光强度随着细胞内钙水平的增加而增加。

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek狮心王外汇安捷伦生2022世界杯附加赛决赛物科技Cytation自动成像仪提供了一个强大而方便的系统来表征Ca^{2 +}使用R-GECO的通量。这种基于自动成像的方法能够灵敏地检测细胞内钙释放和GPCR动力学的详细描述。自动化安捷伦BioT2022世界杯附加赛决赛ekGen5图像预处理和细胞分析工具极大地减少了背景荧光，提供了一个大的分析窗口，并比依赖于总荧光强度测量的方法提高了灵敏度。双试剂注射器和高达20帧/秒的图像捕获速率能够不间断地监测快速细胞事件和复杂信号通路的表征。

图1所示。g蛋白偶联受体(GPCR)信号通路示意图。

材料与方法

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Lionheart FX自动显微镜

狮心FX自动显微镜与增强显微镜是一个全包的显微镜系统，优化的活细胞成像与高达100倍的空气和油浸放大。Brightfield，彩色Brightfield，相位对比和荧光通道为广泛的成像应用提供最大的支持。独特的环境控制盖可孵化至40°C，并有效遏制CO₂/ O₂控制。可用的湿度室和试剂注入器为长期活细胞成像工作流程增加了更高水平的环境优化。Gen5 3.0软件提供自动图像捕捉和分析，以及注释和电影制作功能。Gen5 3.0为广泛的活细胞和固定细胞应用提供了方便和简单，包括灌注分析。

图2．2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Lionheart FX全自动显微镜，带有双试剂注入器模块。

Montana分子R-GECO生物传感器

红色荧光，基因编码Ca^{2 +}指示物(R-GECO)的荧光强度随着细胞内钙水平的增加而增加。⁴最佳R-GECO激发波长为590 nm，发射波长为600 ~ 700 nm。R-GECO可以与Montana Molecular公司的其他GPCR生物传感器配对，包括cADDis，绿色荧光cAMP传感器，或绿色荧光向上和向下二酰甘油(DAG)传感器，同时检测Ca和Ca^{2 +}cAMP或Ca^{2 +}和DAG在活细胞中的作用BacMam传递系统能够在多种细胞类型(包括ipsc来源的心肌细胞)中实现一致和可控的表达。

转导和细胞电镀

HEK293在含10%胎牛血清和5% CO青霉素链霉素的高级DMEM中培养₂37°C。培养在80%合流时常规胰化(0.05%胰蛋白酶- edta)。细胞转染按照Montana Molecular协议进行，体积优化为细胞密度和病毒滴度，以及所需的样品数量。简单地说，将病毒转导反应(20µL R-GECO传感器，0.6 mL 500 mM丁酸钠，5µL hM1受体，24.4µL Advanced DMEM + 10% FBS和pen/strep)添加到700µL 450,000 cells/mL Advanced DMEMcell悬浮液中。轻轻混合后，在Costar 3904 96孔微孔板中每孔播种150 μ L的混合物，然后用铝箔覆盖以避光，并在组织培养罩中孵育30分钟。然后将细胞转移到37°C的培养箱中，在正常细胞生长条件下培养40小时，以确保最佳的传感器表达。

图像的过程

为成像做准备，将培养基替换为100 μ L室温DPBS，让细胞在室温下适应20分钟，同时避光。然后将平板转移到Agilent BioTek Lionheart FX自动2022世界杯附加赛决赛显微镜中，对准试剂注射器，注入Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) + 6倍终浓度的卡巴荷或DPBS。

实验在室温下使用RFP 531/593 LED滤波器立方体组和10倍物镜进行。聚焦使用激光自动对焦。曝光设置进行了优化，以显示R-GECO表达细胞的预激发，同时曝光设置足够低，以适应荧光随时间的显著增加。简单地说，曝光设置如下:LED 10;积分时间100ms;获得7.3。10 FPS捕获率用于表征受体动力学，0.5 FPS捕获率用于涉及双通道采集的百分比响应器实验。在5秒的时间内，用20µL的DPBS加卡巴醇或仅使用载液，总共获得65秒的图像。

细胞分析:受体激活的动力学特征

对具有自动设置的图像进行预处理。安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Gen5对象掩蔽功能可以识别成像领域内的细胞。通过将阈值设置在R-GECO荧光基线以下，该特性用于在细胞周围应用掩膜。推荐的细胞分析设置如表1所示。阈值将根据暴露设置和生物传感器表达水平而变化。

表1。受体激活动力学剖面的图像预处理和细胞分析参数。预处理和对象掩码减少了背景，从而改进了分析和更大的分析窗口。

细胞分析:应答者百分比

Gen5双掩蔽工具提供了进行各种自动化定量分析的能力，包括确定对给定治疗有反应的总细胞的百分比。利用这一特性，在核标记(如hM1结构中包含的核GFP标记)周围设置主掩膜，以生成总细胞计数。然后在RFP通道内围绕初级掩膜展开的二级掩膜被设置，以确定随着时间的推移每个细胞的总RFP荧光。应答细胞的亚群被定义为总荧光水平高于阈值，该阈值高于阴性对照细胞的平均值两个标准差。每种条件的响应百分比是通过将响应细胞与细胞总数的比率计算出来的。表2中包括用于确定应答者百分比的代表性Gen5细胞分析设置，尽管适当的阈值将根据实验条件而变化。

表2．用于确定反应百分比的图像预处理和细胞分析参数。将表1中的预处理设置应用于GFP和RFP通道。

结果与讨论

监测细胞内钙^{2 +}在细胞群内释放G_问-偶联hM1受体激活

R-GECO荧光，随着Ca水平的增加而增加^{2 +}，在基线时最初较低。G刺激_问-偶联的hM1受体通过注射30µM(最终)卡巴醇引起Ca在细胞内的快速动员^{2 +}在HEK293细胞群中R-GECO荧光也相应快速增加。在每个时间点，在R-GECO表达细胞周围放置物体掩膜(图3A)。细胞内钙动员的动力学剖面是使用目标积分荧光值随时间归一化到平均基线荧光水平(T/T₀)．注射激动剂后平均1秒达到最大细胞反应(R-GECO荧光增加5倍)，随后R-GECO荧光水平在大约70秒内逐渐下降，回到接近基线(图3B)。在浓度范围(1 nM至30µM)和EC范围内测定了由卡巴醇添加引起的R-GECO荧光的增加₅₀根据得到的剂量-响应曲线计算53 nM的值(图3C)。

图3。监测细胞内钙^{2 +}随着时间的推移在细胞群内释放G_问-偶联hM1受体激活。(A) HEK293的图像面板，表达红色向上的R-GECO传感器和hhm1受体(上一行)，使用安ilent BioTek Gen5将掩膜放置在含有R-GECO荧光的细胞周围，超过确定的阈值2022世界杯附加赛决赛(下一行)。T = 0, 1, 2, 3分别等于0,0.4,0.9,50秒后注射。(B) R-GECO物体和积分荧光的动力学剖面(F/F₀， n = 8)对G的响应_问-偶联hM1受体激活30 μ M卡巴醇添加(虚线)。(C)卡巴荷剂量-反应曲线(F/F₀， n = 4 /浓度)，计算出EC₅₀值(t =注射后0.9秒)。

表征hM1刺激诱导的单个细胞内钙通量的动力学

采用Gen5插头特征测量Ca^{2 +}在单个细胞内的动员(图4A)，提供了激动剂添加后GPCR激活的详细动力学特征(图4B)。此外，这种基于成像的方法揭示了Ca发生时间的亚细胞差异^{2 +}释放，其中在细胞核之前观察到细胞质内R-GECO荧光的增加。

图4。钙的定量和定性分析^{2 +}在单个HEK293细胞内的动员。使用Gen5插头特性分离单个细胞进行分析，可用于生成GPCR动力学的详细图谱。(A)堵塞工具分离感兴趣的单个细胞来测量Ca^{2 +}随时间变化的通量，揭示了细胞不同区域钙释放时间的亚细胞差异。T = 0, 1, 2, 3分别等于0,0.4,0.9，注射后50秒。(B)定量单细胞分析能够精确地亚秒测量Ca^{2 +}卡巴醇注射反应的通量(虚线)。

量化G_问-使用双掩蔽的百分比响应器耦合hM1激活

采用Gen5双掩蔽法测定添加30 μ M卡巴醇后激活的细胞数。用核定位GFP标记的R-GECO和hM1毒蕈碱乙酰胆碱受体转导的HEK293细胞，用30µM卡bachol刺激，每两秒在RFP和GFP通道中成像一次。在每个GFP阳性细胞的细胞核周围放置初级物体掩模，以产生表达hM1受体的细胞总数。然后使用RFP通道内的二级掩模生成R-GECO荧光增加超过设定阈值的响应细胞计数(图5A)。这种基于成像的自动化检测方法为评估化合物激活GPCR途径的能力提供了一种独特而可靠的方法(图5B和5C)。

图5。．2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen 5成像软件可对细胞进行双重掩蔽，用于百分比响应器计算。用30µM卡bachol刺激核定位GFP标记的R-GECO和hM1毒碱乙酰胆碱受体转导的HEK293细胞，并在RFP和GFP通道中每2秒成像一次。(A)在每个GFP阳性细胞的细胞核周围放置初级物体掩膜。二级掩膜用于测量RFP荧光。T = 0, 1, 2, 3分别等于0,0.4,0.9,50秒后注射。(B)反应率随时间变化的动力学分析提供了一种敏感和可靠的测定GPCR激活的方法(Z' = 0.57)。

结论

安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek Lionheart FX和Cytation自动成像仪是进行各种GPCR相关应用的强大平台，包括检测Ca^{2 +}与R-GECO Ca的通量^{2 +}蒙大拿州分子公司的生物传感器。快速的图像捕获率和双直插式试剂注射器可与这些仪器不间断监测快速细胞反应。2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5图像预处理和细胞分析工具极大地减少了背景荧光，提供了更大的检测窗口，并比依赖于总荧光强度测量的方法提高了灵敏度。GPCR激活可以在人群或百分比应答者测量中使用总细胞荧光定量。使用Gen5插头特性分离单个细胞进行分析，提供了GPCR动力学的详细概况。96孔格式和自动图像捕获和分析提高了GPCR检测的生产率和可重复性。

与R-GECO Ca一起^{2 +}生物传感器、安捷伦BioTek2022世界杯附加赛决赛 Lionheart FX和Cytation成像系统为钙动员研究提供了灵敏而可靠的解决方案。

参考文献

1. Fredriksson, R.和H.B. Schioth，全序列基因组中g蛋白偶联受体的保留。Mol Pharmacol, 2005。67(5): p. 1414-25。
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4. Wu, J.等，改进的橙色和红色Ca(2)+/-指示物和光遗传应用的光物理考虑。美国化学神经科学杂志，2013。4(6): p. 963-72。