暴露于发育毒素的斑马鱼胚胎的自动图像筛选

利用Agil2022世界杯附加赛决赛ent BioTek Gen5数据分析软件量化毒素处理后斑马鱼胚胎的形态变化

作者: Sarah Beckman博士安捷伦科技有限公司

摘要

高通量筛选是一种有价值的方法，用于发现新药，以及发现现有化合物的新用途。许多生物系统被用于毒性筛选，但斑马鱼由于其体积小、成本低和透明的脊椎动物解剖结构，是一种有吸引力的中高通量筛选模型。它们特别适用于一般毒理学筛选，能够捕捉广泛的表型，并且历史上提供了比靶向筛选更多的一流药物。在这篇应用笔记中，我们展示了用几种发育毒素处理的斑马鱼胚胎的高通量筛选和分析。我们将胚胎暴露在乙醇、视黄酸和环巴胺中，然后用安捷伦BioTek在多孔板中捕捉胚胎的亮场图像2022世界杯附加赛决赛狮心王自动显微镜。使用Agilent BioTek分析图像的大小和形状2022世界杯附加赛决赛Gen5数据分析软件。

简介

人类在日常生活中暴露在无数的环境毒素中，包括空气中的细颗粒物、食品包装中发现的化学物质、家庭用品、个人护理产品以及自然产生的化合物，如金属。乐鱼平台入口这种接触与急性毒性和长期后果有关，包括先天性异常、慢性疾病、认知障碍、癌症和死亡。¹这些毒性作用在人类和斑马鱼之间很好地保存着。斑马鱼是复杂的脊椎动物，维持着复杂的机制来激活或减轻外源化学物质的影响。虽然斑马鱼和人类之间的药理作用确实存在差异，但有数百个小分子在鱼和人体内具有保守生物活性的例子。²这种生物活性的守恒使斑马鱼成为毒性筛选的有用模型。

斑马鱼研究毒性的另一个吸引人的特点是它们适合中通量到高通量的实验。胚胎可以放置在多孔板中，以评估其暴露于药物的影响。通过这种方式，斑马鱼已被用于识别致畸物，揭示常见毒物的作用机制，并阐明组织特异性效应。¹斑马鱼模型提供了一个机会，将快速毒理学筛查的力量与研究暴露对脊椎动物的影响的能力相结合，使斑马鱼成为毒理学研究的宝贵系统。

用整个生物体进行毒理学分析的好处之一是可以很容易地进行表型筛选。表型驱动的药物发现方法优于靶标驱动的方法。^3.这部分是由于表型驱动筛选可以识别几乎任何生物过程的化学修饰剂，而基于靶标的方法依赖于对蛋白质靶标的先验选择，因此偏向于发现已充分研究的蛋白质的小分子抑制剂。因此，这种方法不太可能揭示新靶标的功能。此外，最有效的药物可以击中多个目标。基于靶点的筛选会从本质上忽略那些有多个靶点的药物。使用整个生物体进行药物发现的另一个优点是它们提供的生理环境。体外靶向筛选发现的绝大多数小分子在整个生物体中测试时表现出不良特征(如缺乏特异性或毒性)。相比之下，通过在整个生物体中引起理想表型的能力而发现的小分子更有可能是细胞可渗透的，没有明显的毒性，并且有效。⁴

为了提高吞吐量和消除主观性，高含量成像(HCI)技术的进步提供了自动化数据收集和图像分析的方法。⁵由于斑马鱼对小分子的渗透性和透明度，它们适合高含量成像。此外，大量胚胎可以快速获得，并用于评估多种药物的筛选方法的效果。斑马鱼胚胎成像的自动化有可能减少时间，增加检测的再现性和客观性。然而，在发育中的斑马鱼筛选限速程序之一是每个幼虫的形态评估。所需要的是客观、准确和快速的方法来筛选斑马鱼的畸形。

本研究使用斑马鱼，结合延时成像和Agilent BioTek Gen5微孔板读取器和成像仪软件，分析毒素暴露后的斑马鱼胚胎形状。2022世界杯附加赛决赛胚胎在发育早期用几种毒素处理，然后生长到受精后2至6天(dpf)。胚胎在96孔板中成像，大小和形状测量使用Gen5确定。在这些参数中，胚胎被分为基本形状，如圆形、直形、短形和弯曲形。

材料与方法

斑马鱼的维护

斑马鱼基本上是按照韦斯特菲尔德的描述维持的⁶．将成年斑马鱼(雄性和雌性)混合，在28°C下维持，光照/暗周期为14/10小时。为了收集胚胎，雄性和雌性斑马鱼在前一天晚上被放入繁殖篮，早上收集胚胎。斑马鱼胚胎在28°C的培养箱中，E3培养基(5 mM NaCl, 0.33 mM MgSO4, 0.33 mM CaCl)中保存₂， 0.17 mM KCl，和0.1%亚甲基蓝)。

药物治疗

12个胚胎分别放置在12孔板的8孔中。环巴胺(Tocris, Minneapolis, MN)、维甲酸(Tocris)和乙醇(Sigma, St. Louis, MO)均在E3培养基中稀释。每孔加两毫升。毒素治疗开始于不同的发展阶段。环巴胺治疗开始于8细胞期。从尾芽开始进行乙醇处理。维甲酸治疗开始于屏蔽期。除乙醇处理外，胚胎在成像前均生长至2 dpf。乙醇处理的胚胎生长到6 dpf。

成像

治疗后，胚胎用pronase (Sigma)去水平，用三卡因(Sigma)处理，直到它们对触摸无反应，并放置在96孔板中(康宁3904，纽约坎顿)。在96孔板的情况下，胚胎被放置在孔的中心，并以4倍的速度拍摄3x4蒙太奇。为了进一步的视觉分析，图像在手动模式下以10倍的速度使用组合z-stack蒙太奇拍摄。在所有情况下，图像都是使用安捷伦BioTek Lionheart FX自动显微镜使2022世界杯附加赛决赛用亮场通道拍摄的。

图像分析

图像蒙太奇使用Gen5默认设置拼接在一起。然后对图像进行预处理，去除背景，便于识别胚胎形状。背景设置为“浅色”，滚动的球保持Gen5的默认设置。最后，进行图像分析，创建一个初级掩模来勾勒每个胚胎的形状。主掩码的参数和预处理步骤如表1和图1所示。

图1．成像和分析参数。对井进行4×3蒙太奇(A)，然后将图像拼接在一起(B)。使用图像预处理减去背景(C)，用初级掩模分析胚胎形状(D)。

表1．2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5软件设置，用于拼接、图像预处理和细胞分析。在拍摄图像蒙太奇之后，单独的图像帧被缝合在一起。图像预处理从图像中去除背景，以方便掩蔽胚胎周围。细胞分析在胚胎周围创建一个掩膜，以便计算图像形状参数。

结果与讨论

乙醇是最常被消费和滥用的药物。暴露于特定毒素后的胚胎形状通常与药物靶向的途径直接相关。在这种情况下，暴露于乙醇的斑马鱼幼虫会出现发育畸形，包括骨骼畸形、轴缩短和发育迟缓在尾芽期(受精后10小时(hpf))用0、1或2%乙醇处理斑马鱼胚胎，并生长至6 dpf。胚胎形态参数包括长度、延伸率、长宽比、圆度、形状因子和宽度。表2详细描述了这些参数。对照组胚胎与1%乙醇处理胚胎差异不大。然而，经2%乙醇处理的胚胎轴缩短，呈圆形形态，宽度增加。图2对此进行了量化。

表2。自定义和默认的Agilent BioT2022世界杯附加赛决赛ek Gen5图像分析参数用于描述斑马鱼胚胎周围主要面罩的大小和形状。

甾体生物碱环巴胺具有致畸性和抗肿瘤活性，这源于其特异性阻断细胞对脊椎动物hedgehog信号的反应的能力Sonic Hedgehog基因(shh)用于指定脊髓的腹侧结构。如果这个信号缺失，脊髓就会背侧化，中线结构就不能正常形成，从而导致弯曲的身体结构在本实验中，用8倍稀释的环巴胺从100 μ M开始处理斑马鱼胚胎。治疗开始于8细胞阶段(1.25 hpf)直到2 dpf。使用Agilent BioTek Gen5对胚胎形态进行量化，可以观察到对胚2022世界杯附加赛决赛胎大小和形状(包括胚胎曲率)的大致剂量依赖效应。胚胎似乎在>12.5µM处理时受到的影响最大:使用≤12.5µM处理的胚胎表现出与未处理胚胎相似的表型;而>12.5µM处理的胚胎表现出卷曲的表型和扭曲的尾部。图3对此进行了量化。

图2。暴露在乙醇中的胚胎表现为短而圆的表型。(A)对照胚胎(B)暴露于1%乙醇的胚胎(C)暴露于2%乙醇的胚胎。(D-G)每种处理计算的形状参数的比较。

视黄酸(RA)是一种天然的形态发生物，从维生素a中提取。用RA治疗会干扰正常的前后轴发育。过量的RA起着后退剂的作用。因此，在最高剂量的处理胚胎中，缺乏头部前部结构和缩短体长¹⁰．尾巴的生长也会受到影响，这是RA的后期影响，导致尾巴变短¹¹．以64 μM为起始浓度，用8倍2倍稀释维甲酸溶液处理斑马鱼胚胎。治疗从屏蔽细胞阶段(6 hpf)到2 dpf。再次用Gen5定量胚胎形态。胚胎似乎在所有治疗中都受到影响，并呈现出短尾和弯曲的表型，这是剂量依赖的。图4对此进行了量化。在最高剂量下，胚胎呈现出更圆形的表型，这让位于更弯曲的表型，然后是更直的表型。这可以用第5代亚群体分析进行量化。

图3。暴露于环巴胺的胚胎表现出弯曲的表型和扭曲的尾巴。(A) 100 μM环巴胺(B) 50 μM (C) 25 μM (D) 12.5 μM (E) 6.25 μM (F) 3.125 μM (G) 1.5625 μM (H) 0 μM (I-L)各处理计算形状参数的比较。

图4．暴露于维甲酸的胚胎后退，尾部缩短。(A) 64 μM (B) 32 μM (C) 16 μM (D) 8 μM (E) 4 μM (F) 2 μM (G) 1 μM (H) 0 μM (I-L)各处理计算形状参数的比较

使用表3中列出的参数来识别胚胎的一般形态特征，如直、圆、弯和短。快速查看图5所示的板图，可以大致了解96孔板中每个孔中胚胎的形态。由于井底碎屑影响了图像分析，其中3口井被排除在外。

在进行基本形状评估后，研究人员将进一步深入到更详细的形态评估中。为此，选择胚胎可以进一步成像，以获得更多的细节。如图6所示，其中采用了胚胎的10倍蒙太奇z-stack，提供了进一步确定特征程度的细节，如轴缩短、后退、色素沉淀和水肿。

表3。定义用于确定哪些胚胎是直的、圆形的、弯曲的或短的参数。

图5。RA处理胚胎的外形参数。根据表3中列出的参数，将图像分为4类:直线、圆形、弯曲或短。

图6。维甲酸处理过的胚胎的10倍图像可以进一步评估毒性。(一)64μM (B) 32μM (C) 16μM (D) 8μM (E) 4μM (F) 2μM (G) 1μM (H) 0μM。

结论

进行高通量成像和分析的能力对于毒理学筛选是必不可少的。本应用说明表明，使用安捷伦BioTek Lionheart FX自动显微镜和安捷伦BioTek Ge2022世界杯附加赛决赛n5数据分析软件，可以对96孔板中的斑马鱼进行成像和分析，处理过不同剂量的发育毒素。本笔记演示了图像形状参数的剂量依赖效应，以及通过基本形态特征(如圆形、弯曲、直或圆形)对胚胎进行分类的策略。由于形状与功能直接相关，胚胎的形状可能会让研究人员知道，当未知化合物产生有趣的撞击时，应该开始探索什么途径。结合使用脊椎动物模型的高通量成像和分析，使其成为一种有吸引力的中高通量毒理学筛查方法。

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