中性粒细胞网状坏死活性的自动分析

使用安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k Lionheart FX成像和分析受刺激的dHL-60细胞

作者: Paul Held，博士，安捷伦科技公司

摘要

中性粒细胞在人体防御感染中发挥着关键作用，作为先天免疫系统的一部分，它们采用多种策略来降解和杀死微生物，包括释放中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)。NETs是一种网状结构，由抗菌蛋白和DNA组成，在一种被称为NETosis的独特的程序性中性粒细胞死亡过程中释放。一般来说，NETs允许中性粒细胞杀死细胞外病原体，同时最小化对宿主细胞的损伤，但也可导致自身免疫反应。这一过程在体内还没有很好地了解，并发展起来在体外模型手段进一步阐明这一现象的机理和结果是可取的。本应用笔记描述了安捷伦BioTek的使用2022世界杯附加赛决赛狮心王外汇成像器成像并分析被刺激发生网络坏死的分化HL-60细胞在体外．

简介

中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)是细胞外纤维网络，主要由中性粒细胞的DNA组成，它与病原体结合。¹中性粒细胞是数量最多的白细胞，也是免疫系统抵御感染的第一道防线。传统上，人们认为中性粒细胞可以通过吞噬微生物或分泌抗菌素来杀死入侵的病原体。²2004年，布林克曼发现了第三个功能，即NETs的形成等．¹高分辨率扫描电子显微镜显示，NETs由直径分别为15 ~ 17纳米和25纳米的DNA和球状蛋白结构域组成，它们可以聚合成直径为50纳米的更大的线在脉管系统的流动条件下在活的有机体内，就能形成更大的结构。^3.

图1所示。NETosis过程。

在PMA刺激后，NETosis通过NADPH氧化酶刺激被激活。NADPH氧化酶协助中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)从胞质颗粒转位到细胞核，在那里它通过组蛋白裂解协助染色质分解。髓过氧化物酶(MPO)是染色质和核膜分解以及NET液泡内颗粒混合所必需的。细胞内网状细胞形成后，中性粒细胞外膜破裂，成熟的网状细胞被挤出。

免疫荧光显示NETs含有来自几种不同中性粒细胞颗粒的蛋白质以及细胞核，但缺乏许多常见的细胞质蛋白，如肌动蛋白和微管蛋白。^1、4NETs提供局部高浓度的抗菌成分，可在细胞外独立于吞噬吸收的情况下结合、解除和杀死微生物。颗粒蛋白进入NETs也可能阻止蛋白酶等潜在的有害蛋白质扩散，并在炎症部位附近的组织中诱导损伤。

完整的NETosis激活途径仍在研究中，但一些关键蛋白质已经被识别出来。NETosis途径可以通过激活toll样受体(TLRs)、Fc受体和补体受体与各种配体，如抗体、PMA和IL-8启动。^5、6PMA通过激活蛋白激酶C、raf -丝裂原激活蛋白激酶和(MEK) -细胞外信号调节激酶(ERK)通路进行刺激后，下游信号导致内质网释放钙。细胞内钙的涌入进而激活NADPH氧化酶，通过活性氧(ROS)中间体引起蛋白质精氨酸脱亚胺酶4 (PAD4)的激活。PAD4负责中性粒细胞中组蛋白的瓜氨酸化，导致染色质的解凝。嗜蓝性颗粒蛋白如髓过氧化物酶(MPO)和中性粒细胞弹性酶(NE)进入细胞核并进一步进行解凝过程。最终，核膜破裂，未浓缩的染色质进入细胞质，在那里额外的颗粒和细胞质蛋白被添加到早期的NET。该过程的最终结果取决于自杀或重要的NETosis通路是否被激活(图1)。⁷自杀性NETosis最早于2007年被描述，证明NETs的释放通过不同于凋亡或坏死的途径导致中性粒细胞死亡。⁵在自杀性nettosis中，细胞内NET的形成伴随着质膜的破裂，将其释放到细胞外空间。另一方面，严重的网状病变导致细胞核起泡，产生一个充满dna的囊泡，囊泡被排出，而质膜完好无损。虽然不能存活，但中性粒细胞可以继续吞噬和杀死重要的nettosis后的微生物。⁶值得注意的是，自杀式的网络中毒可能需要几个小时，而重要的网络中毒可能在几分钟内完成，这意味着不同的功能。

本应用笔记演示了一种在体外活细胞检测以分化HL-60细胞为模型监测NETosis活性。该方法的基础是利用荧光显微镜动态跟踪细胞膜完整性，使用细胞膜透性和不渗透核染色剂。这允许确定NETosis活性的抑制剂效力。

材料和方法

试剂

RMPI-1640组织培养基、胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺和青霉素/链霉素均来自Life Technologies公司。HL-60人早成髓细胞细胞来自ATCC (Manassas, VA)。核红和核绿染色剂来自开曼化学公司(Ann Arbor, MI)。DMSO和ATRA，采购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。兴奋剂和抑制剂小分子化合物，PMA，尼日霉素，A23187, DPI, Go 6976，诺可达唑，罗罗布宁，ML 171, VAS 2870，和NoxA 1ds从Tocris Bioscience(明尼阿波利斯，MN)购买。

细胞培养

HL-60细胞在RPMI-1640 + 10% FBS + 2 mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素中培养。悬液细胞每2 ~ 3天以1:5与新鲜培养基分离。HL-60细胞稀释至1 × 10⁵在1.25% DMSO和0.1µM ATRA条件下培养4 ~ 5天，分化为中性粒细胞(图2)。

图2。HL-60早幼粒细胞白血病细胞的分化。培养的HL-60细胞暴露于1.25% DMSO和100 nM ATTRA下5天，诱导其向中性粒细胞分化。收集分化的HL-60细胞(dHL-60)，在37°C用核红染色30分钟。然后将细胞颗粒化，在电镀前立即添加核绿染色剂。

染色

计数分化的HL-60细胞(dHL-60)，取1.2 × 10⁶细胞在15 mL锥形管中离心成球。将细胞重悬于6 mL PBS中，加入核红染色液6µL。细胞在37°C孵育30分钟，然后加入额外的6 mL PBS，再次离心成球。将细胞重悬于12 mL NETosis成像缓冲液(PBS, 0.5% w/v BSA, 0.1% w/v葡萄糖)中，其中加入12µL的核绿染色剂，并立即将(100µL, 20,000个细胞/孔)alibid(100µL, 20,000个细胞/孔)放入康宁(产品号3904)96孔、黑色边、透明底的微孔中(图3)。

图3．NETosis刺激和抑制试验过程。用核红和核绿染料预染色的已分化的HL-60 (dHL-60)细胞，在加入NETosis刺激剂(如PMA)之前被添加到不同浓度的NETosis抑制剂中。在加入刺激物后，通过GFP和CY5通道的成像监测NETosis。

使用几种不同的化合物来刺激dHL-60细胞发生网状坏死。将NETosis成像缓冲液中的复合稀释剂以2倍于所需浓度的100 μ L添加到孔中。然后将细胞以100 μ L的浓度添加到孔中，在200 × g的条件下离心60秒，使非粘附细胞置于孔底。离心后立即开始成像。

研究了几种潜在抑制剂的能力，以减少或消除化合物诱导的NETosis刺激。抑制剂化合物在NETosis成像缓冲液中稀释(100 μ L)，以3倍最终预期浓度稀释到微板孔中。如上所述染色的dHL-60细胞(100 μ L)被添加到抑制剂稀释液中，在RT下孵育15分钟，之后添加100 μ L的3倍终浓度NETosis刺激剂。如前所述，将平板离心并成像。

成像

培养细胞使用安捷伦BioTek Lionheart FX成像2022世界杯附加赛决赛仪配置亮场，以及GFP和CY5 LED立方体进行成像。该成像仪使用LED光源结合带通滤波器和二色镜来提供适当波长的光。使用20x物镜每15分钟动态拍摄一次图像，持续4小时。采用激光自动聚焦(LAF)技术对每口井的图像进行自动聚焦。使用聚焦的CY5荧光图像获得LAF参考扫描(图4)。

图4。细胞染色。使用NETosis成像检测试剂盒(Cayman Chemical, Ann Arbor MI)对细胞进行染色，其中包括核红和核绿染色的组合。细胞渗透性红色染色用于设置初始激光自动聚焦(LAF)参数，而不渗透性绿色染色用于监测NETosis。

分析

成像后，细胞分析使用5000的阈值识别GFP对象(图5)。为了排除碎片，对象掩膜没有被分割成单个对象，但被限制在大于10 μ m的大小。掩膜上的孔被填满，沿成像边缘的物体也被包括在物体面积度量测定中(表1)。

图5。对象区域分析。使用安捷伦BioTek Gen5软件中的细胞分析数据缩减选项识别NETs。2022世界杯附加赛决赛对每一个20x图像确定总的目标区域。

表1。NETosis的图像捕获和图像分析参数。

使用Agilent BioTek Gen5图像分析软件自动计算每口井在每个时间点的GFP目标总面积。2022世界杯附加赛决赛这些图的积分或曲线下面积(AUC)由Gen5自动确定(图6)。使用GraphPad Prism 7将结果的AUC与化合物(兴奋剂或抑制剂)浓度绘制成图形。

图6。总绿化面积的积分。测定了动力学实验中每口井各时间点的绿色荧光总靶面积。根据实验结果，每口井的曲线下面积(AUC)或动力学图的积分将自动计算出来，并与化合物(兴奋剂或抑制剂)浓度进行对比。绿色和红色条纹分别代表阳性对照和阴性对照的AUC。

结果与讨论

测试了不同化合物对dHL-60细胞NETosis的刺激能力。通过绘制动力学曲线的AUC作为化合物浓度的函数，可以确定各种NETosis刺激剂或抑制剂的效力。复方茯苓12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)被发现是一种有效的NETosis刺激物。PMA与EC以浓度依赖的方式起作用₅₀PMA模拟二酰基甘油，并与蛋白激酶C (PKC)结合，激活激酶。下游效应包括促进细胞生长和炎症。⁸

图7。PMA浓度对nettosis的影响。dHL-60细胞用不同浓度的PMA在核绿染色剂存在下处理。动力学图像的分析确定了每口井的绿色荧光的总NETosis面积作为时间的函数。将每条动力学曲线的AUC绘制为PMA浓度的函数。每个数据点代表8个测定的平均值。

通过GFP荧光测定，电离层化合物A23187和尼日霉素也被证明可诱导NETosis，且具有浓度依赖性。然而，这些化合物的活性明显低于PMA(图8)。A23187是一种钙离子载体，除了直接促进细胞外钙移动到细胞内，还激活磷脂酶c依赖性的细胞内钙的动员^{2 +}商店。⁹尼尼霉素是一种从吸湿链霉菌中提取的抗生素，据报道作为钾离子载体，可以激活NLRP3炎症小体。¹⁰

图8。不同NETosis兴奋剂的药效比较。dHL-60细胞分别用不同浓度的PMA、A23187或尼日霉素在核绿染色剂的存在下处理。动力学图像的分析确定了每口井的绿色荧光的总NETosis面积作为时间的函数。计算每条动力学曲线的AUC，并绘制为最大化合物浓度下AUC的百分比。每个数据点代表8个测定的平均值。

NETosis在活的有机体内已报道通过NADPH氧化酶(NOX)的作用。因此，可以预期NOX抑制剂将改善NETosis兴奋剂的效果。如图9所示，二苯硫碘(DPI)对PMA (100 nM)刺激下的NETosis具有抑制作用，且具有浓度依赖性。有趣的是，该化合物对电离体A23187或尼日霉素无效。这表明这些化合物主要通过它们的电离胞活性而不是真正刺激NETosis起作用。

图9。二苯碘(DPI)对dHL-60细胞NETosis刺激的抑制作用。先用不同浓度的DPI预处理分化的HL-60细胞，然后再加入100 nM PMA、25 μ MA 23187或25 μ M尼尼霉素(存在核绿染色剂)刺激细胞。利用Agilent BioTek Gen5分析软件计算各井荧光总面积的动力学图积分(AUC)。2022世界杯附加赛决赛数据以未处理阳性对照的总面积百分比表示，并绘制为DPI浓度的函数。每个数据点代表8个测定的平均值。

我们测试了几种化合物对PMA对NETosis的抑制作用。如图10所示，DPI在抑制PMA产生的NETosis方面明显比PKC抑制剂Go 6976更有效。欧共体₅₀Go 6976的浓度大约是DPI观察到的浓度的20倍。此外，有效抑制约为DPI观察到的一半。干扰微管聚合的诺可达唑和一种已知的细胞周期抑制剂对预防NETosis无效(图9)。

图10。细胞抑制剂对PMA刺激dHL-60细胞的影响。分化的HL-60细胞分别用不同浓度的DPI、Go 6976或诺可达唑进行预处理，然后在核绿染色剂存在下加入100 nM PMA刺激细胞。计算了每口井的总荧光面积的动力学图的积分(AUC)。数据以未处理阳性对照的总面积百分比表示，并绘制为抑制剂浓度的函数。每个数据点代表8个测定的平均值。

NOX抑制剂DPI在抑制PMA诱导的NETosis方面的有效性促使我们测试其他已知NOX抑制剂的有效性。在测试的抑制剂中，DPI具有最大的效力(图11)。有趣的是，非特异性的NOX抑制剂，如DPI、罗布钦和VAS 2870都有一定程度的疗效，而NOX 1特异性的抑制剂几乎没有效果(图10)。

图11。NADPH氧化酶抑制剂对dHL-60细胞PMA刺激的影响。分化的HL-60细胞分别用不同浓度的DPI、VAS 2870、罗布辛素、NoxA 1ds和ML 171进行预处理，然后在核绿染色剂存在下加入100 nM PMA刺激细胞。计算每口井的总荧光面积的动力学图的积分(AUC)，表示为未处理阳性对照的总AUC %，并绘制为抑制剂浓度的函数。每个数据点代表8个测定的平均值。

结论

以分化的HL-60 (dHL-60)细胞为基质细胞在体外人体中性粒细胞模型。dHL-60细胞表现出与新鲜分离的人类细胞相同的nettosis反应，为更好地理解这一现象提供了良好的模型。NETosis用核红和核绿联合染色后进行成像检查(开曼化学)。虽然这两种染色与核酸结合并产生荧光，核红染色是一种细胞渗透性染色，可以染色活细胞核，核绿染色是不渗透的，只有当细胞膜被破坏时才会荧光。初始成像和聚焦使用CY5 LED立方体来完成，该立方体检测所有核红染色细胞的细胞核。网状病时，细胞膜可被核绿染料渗透。染料的进入使绿色荧光增加，因为它与核DNA结合。随着时间的推移，核膜破裂，核质和细胞质混合，核内容物释放。细胞外DNA也可被核绿色试剂所接触，从而产生更大面积的绿色荧光。

phorbol酯PMA被证明能刺激HL-60细胞的NETosis，这些细胞已分化为中性粒细胞，且呈剂量依赖性。NADPH氧化酶抑制剂如DPI也可以抑制这种效果。电离体如尼尼霉素和A23187被证明具有类似的作用，但不能被DPI抑制，这表明它们的作用不是NETosis的药理学作用，而是由于电离体允许膜非永久性染料进入细胞核酸。NOX抑制剂的数据表明，虽然NADPH氧化酶蛋白活性是NETosis所必需的，但NOX1并不是直接负责这种活性的亚型。

这些数据表明，安捷伦BioTek Lionheart FX成像微2022世界杯附加赛决赛板阅读器结合安捷伦BioTek Gen5数据分析软件可用于定量中性粒细胞的NETosis在体外．Lionheart FX是进行这些研究的理想平台。该成像仪保持读腔内的生理温度，以及在动力学成像期间使用湿度板载体提供湿度。2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Gen5数据分析软件控制成像器的动力学成像时间以及自动识别和量化荧光染色区域。然后将这些数据绘制成单个井的动力学图，并计算积分(AUC)。后续的AUC测定可用于浓度相关图。

参考文献

1. 布林克曼，V.， U.瑞查德，C.古斯曼，B.福勒;Y. Uhlemann, D. S. Weiss, Y. Weinrauch, A. Zychlinsky(2004)。中性粒细胞胞外陷阱杀死细菌。科学。303 (5663):1532-1535 doi:10.1126/ Science. 1092385。PMID 15001782。
2. Witko-Sarsat V;Rieu P, Descamps-Latscha B, Lesavre P, Halbwachs-Mecarelli L(2000)。中性粒细胞:分子、功能和病理生理方面。实验室投资。80(5):617-53。doi: 10.1038 / labinvest.3780067。PMID
3. Clark SR, Ma AC, Tavener SA, McDonald B, Goodarzi Z, Kelly MM, Patel KD, Chakrabarti S, McAvoy E, Sinclair GD, Keys EM，艾伦- vercoe E, Devinney R, Doig CJ, Green FH, Kubes P(2007)。血小板toll样受体-4激活中性粒细胞胞外陷阱诱捕内毒素血症和脓毒性血中的细菌。自然医学，13(4):463-469。doi: 10.1038 / nm1565。PMID 17384648。
4. 城市CF, D. Ermert, M. Schmid, U. Abu-Abed, C. Goosmann, W. Nacken, V. Brinkmann, P.R. Jungblut, A. Zychlinsky(2009)。中性粒细胞胞外陷阱含有钙保护蛋白，这是一种参与宿主防御白色念珠菌的胞质蛋白复合体。PLOS病原体。
5. (10): e1000639。PMC 2763347。doi: 10.1371 /杂志。ppat。1000639.5.福克斯,t . a;U. Abed, C. Goosmann, R. Hurwitz, I. Schulze, V. Wahn, Y. Weinrauch, V. Brinkmann, A. Zychlinsky，(2007)。新的细胞死亡程序导致中性粒细胞细胞外陷阱。细胞生物学杂志，176(2):231-241。 doi:10.1083/jcb.200606027. ISSN 0021- 9525. PMC 2063942. PMID 17210947.
6. 杨浩，M.H.比尔曼，J.M.布劳内，刘莹，赵莹，M.赫尔曼(2016)。对中性粒细胞细胞外陷阱的新认识:形成机制和在炎症中的作用。免疫学前沿。7:302。PMID 27570525。doi: 10.3389 / fimmu.2016.00302。ISSN 1664 - 3224。PMC 4981595。
7. Jorch, s . k .;p . Kubes(2017)。中性粒细胞细胞外陷阱在非感染性疾病中的新作用。自然医学。23(3):279-287。doi: 10.1038 / nm.4294。ISSN 1078 - 8956。PMID 28267716。
8. Moscat Jorge;Diaz-Meco,玛丽亚T;Paul Rennert(2003年1月)。NF-κB蛋白激酶C亚型的活化及b细胞功能。EMBO报告。4(1):31-36。doi: 10.1038 / sj.embor.embor704。PMC 1315804。
9. Dedkova, E.N, A.A. Sigova, V.P. Zinchenko(2000)钙离子团对完整细胞的作用机制:离子团抗性细胞，膜细胞生物学，13(3):357-368。PMID 10768486
10. Munoz-Planillo R;Kuffa P;Martinez-Colon G;史密斯,提单;Rajendiran TM;Nunez G(2013)。K⁺外排是细菌毒素和颗粒物质激活NLRP3炎症小体的常见触发器。免疫。38(6):1142-53。doi: 10.1016 / j.immuni.2013.05.016。PMID 23809161。