2022卡塔尔世界杯完整赛程资源-应用说明

应用机器人技术在显微技术中的应用

下载

相关产品:乐鱼平台入口BioStack，2022世界杯南美区预选赛 ，第5代成像

2014年11月6日

作者:温迪·古德里奇，安捷伦科技有限公司

简介

从历史上看，显微镜一直是一种动手操作的方法，可以限制样品处理中的更高通量选项。最近，显微镜中样品处理的选择已经从自动化数字显微镜的引入和显微镜载玻片技术对微孔板或其他高通量格式成像的适应扩展。其中一个适应性的例子是组织微阵列(TMA)，这种技术可以在单个显微镜载玻片上排列数百个直径小至0.6毫米、2至5微米厚的单个组织核，从而增加了许多常见组织学程序的吞吐量。tma(图1和图2)已被证明在许多应用中非常有用，如活检和其他组织样本的生物库和存档、临床疾病诊断、分类和分级、质量控制、抗体和染色优化。tma还用于帮助满足美国FDA监管文件“向FDA提交免疫组化应用指南”所要求的“所有类别IHC的正常组织或细胞组免疫反应性的验证和验证”等标准;行业最终指南”。1、2

两个TMA载玻片放置在与多模式成像阅读器的机器人接口兼容的载玻片支架中

图1所示。(A)两张TMA幻灯片被放置在与安捷伦BioTek多模式成像读取器的机器人接口兼容的幻灯片固定器中(B)。软件被预先编程，依次将每个幻灯片固定器从机器人加载到成像仪，然后使用自动蒙太奇2022世界杯附加赛决赛和拼接功能捕获每张幻灯片的15 × 15张图像，以说明最终阵列，如图所示，其中一个TMA以4倍的速度(C)。

由于其独特的几何形状和安装技术，tma被选为高通量演示蒙太奇和拼接图像优化的模型。在切片机切片后，将石蜡化的TMA切片放入水中，将显微镜载玻片浸在薄片下，并从水浴中抬起以捕获阵列。虽然有一个窗口的时候,TMA可以重新定位在幻灯片上,这种方法的结果是,即使是相同数量和规模的核心小组不得安装相同的中心偏置显微镜幻灯片上(图2)。此外,一些蓝玉可能有也可能没有标记的核心,可以抵消剩余核(图2)。此外,虽然安捷伦BioTek显微镜幻灯片适配器设计标准25×75×1毫米显微镜幻灯片,2022世界杯附加赛决赛在校准成像的x、y偏移时，应包括一些公差，以补偿机器人转移和/或图像载体定位期间可能的滑动运动。

两个9 x 8的组织微阵列(tma)在显微镜载玻片上显示不同的偏移位置。

图2。两个9 × 8组织微阵列(tma)在显微镜载玻片上显示不同偏移位置。底部的幻灯片包括一个标记核心，通常嵌入到数组中作为控制和帮助识别面板位置，但也增加了数组之间的不对称定位。安捷伦BioTek Gen5软件中提供的定制x、y偏移、蒙太奇和拼接选项可用于在Agilent BioTek Cytation 5成像期间补2022世界杯附加赛决赛偿这些几何异常，允许混合大小的TMAs通过Agilent BioTek BioStack 4机器人以更高的吞吐量一起运行。

为了演示为克服高通量自动化TMA所面临的挑战而设计的最佳图像采集设置，将两组苏木精和伊红(H&E)染色的1.5 mm 72芯TMA载玻片和六组H&E染色的1.5 mm 24芯TMA载玻片装入4个显微镜载玻片支架中(图1A)，并在安ilent BioTek BioStack 4供应塔中垂直堆叠(图1B)。2022世界杯附加赛决赛2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5软件按顺序将每个载片支架从安捷伦BioTek BioStack微孔板堆叠器加载到安捷伦BioTek Cytation 5成象器，并在每次成像后将载片适配器返回BioStack接收塔。TMA和单个核心在彩色亮场中以2.5倍、4倍、10倍、20倍和40倍成像，以了解每个物镜的最佳焦点高度、x、y偏移值、蒙太奇大小和拼接重叠设置(其中一组如图4所示)。为了进行比较，包括由区域组织实验室捐赠的DAPI染色废弃TMA原型的图像，以说明从同一仪器独立获得的TMA的荧光成像。

材料与方法

材料

  • 一套FDA人类正常器官组织，美国Biomax公司(零件号FDA802) h&e染色，微阵列面板(如图7所示)和核心规格表:https://www.biomax.us/FDA802-1
  • 6种前4种癌症测试组织，US Biomax, Inc.(零件号TP242) h&e染色，微阵列面板如图6所示，核心规格表:http://www。biomax.us / tissue-arrays Multiple_Organ / TP242
  • 地区组织实验室捐赠的废弃DAPI染色TMA载片原型(甲状腺癌和腺瘤组织阵列，包括TNM和临床分期，美国Biomax, Inc.(零件号TH641未染色)
  • 2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek幻灯片适配器(部件号1220548)
  • 2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek BioStack 4接口(部件号7310053)

设备

2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Cytation 5成像多模式阅读器

Cytation 5是一个独特的集成，可配置的系统，结合了自动化数字宽视场显微镜与传统的多模式微板检测。该仪器取代了多个模块和软件接口，安装和操作简单。显微镜模块提供高质量的细胞和亚细胞成像，荧光，亮场，彩色亮场和相位对比通道，最高可达60倍放大倍率和s/w控制炮塔，可容纳6个机载物镜。多模检测模块采用安捷伦BioTek混合技术，该技术结合了可变带宽单色光学和高灵敏2022世界杯附加赛决赛度滤波器检测光学。震动，温度控制到65°C，加上可用的CO2/ O2控制和双试剂注射器优化活细胞动力学成像和检测的条件。

Cytation 5成像仪和BioStack 4使用集成试剂盒连接

图3。Agil2022世界杯附加赛决赛ent BioTek Cytation 5成像仪和Agilent BioTek BioStack 4使用Agilent BioTek集成套件(部件号7310053)进行接口，如图所示。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek BioStack 4微孔板堆垛机

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek BioStack 4是一款紧凑而多功能的微孔板堆叠机，与安捷伦BioTek洗衣机、分配器、探测器和成像系统兼容。BioStack 4独特的载体设计提供了快速的传输速度，以提高吞吐量和提高生产力。BioStack 4具有符合人体工程学的仪表板访问旋转夹具。获得专利的BioStack 4提供板清除和可靠的能力，非常适合敏感的基于细胞的分析。BioStack 4与显微镜载玻片适配器(零件号1220548)兼容，如图1B所示。利用Cytation 5可以轻松地完成游离批量显微镜切片成像。BioStack模型可提供10、30或50个载体存储堆栈，所有可移动和可互换，以适应个人的吞吐量需求。这里介绍的应用程序使用了30载波堆栈。使用Cytation 5校准装置的说明可在操作手册(部件号7311000)和相关的安装-操作BioStack与Cytation章节中找到。注意，当集成Cytation 5成像仪和BioStack 4时，两个单元应该处于平等的水平基础上。 In place of the Cytation 5 isolation table, a BioStack integration kit should be used, making physical calibration seamless between the two units. During z-height calibration of the robotic arm to the Cytation 5 carrier, the grippers should be calibrated 100 to 400 steps beneath the bottom of the Cytation 5 carrier to snugly snap the slide adapter into place during transfers. When loading microscopy slide adapters to the robotic supply tower, the slide holder should be loaded so the A1 marker is at the back left corner of the supply tower when loaded and locked into place on the BioStack 4.

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Gen5 v2.07软件

机器人控制、图像捕捉、数据收集以及图像和数据分析都由Gen5软件驱动。对于这里描述的应用，分别在2.5倍、4倍、10倍、20倍和40倍放大倍率下使用彩色亮场、荧光和数字相位对比。如方法部分所述，使用了Gen5中可用的图像蒙太奇和拼接以及单一成像特征。图4显示了将BioStack 4添加到Gen5的用户界面面板，启用与机器人一起使用的成像仪界面，以及启用BioStack时在Gen5中可用的运行时选项。

用于集成BioStack 4和Cytation 5成像仪的Gen5用户界面(顶部和中间)，以及启用BioStack 4时运行时可用的选项(底部)。

图4。2022世界杯附加赛决赛Agilent BioTek Gen5用户界面，用于集成Agilent BioTek BioStack 4和Agilent BioTek Cytation 5成象仪(A和B)，以及启用Agilent BioTek BioStack 4时运行时可用的选项(C)。

方法

使用h&e染色的72芯TMA确定自动化TMA成像的最佳图像采集设置。将TMA放入载玻片适配器中，然后在Gen5软件的协议定义接口下，以4倍放大的彩色亮场，手动模式建立x、y偏移量和蒙太奇参数(图5)。在支架上放置第二个72芯TMA，根据定义的参数对两张载玻片进行成像。成像后，其中一个tma轻微偏移，另一个位于中心。X,y偏移量优化在第二张幻灯片上。然后将两个读取步骤编程到协议中，以便所有tma将以两种不同的几何构型成像。

6个H&E染色的1.5 mm 24芯TMA载玻片装入另外3个Agilent BioTek显微镜载玻片支架中，所有4个支架均垂直堆叠在BioSta2022世界杯附加赛决赛ck 4供应塔内。Gen5软件按顺序将每个载片支架从机器人加载到Cytation 5成像仪，并在每次成像后将载片适配器返回到堆叠机接收塔。使用定义的协议对tma和单个核进行成像。在运行之后，图像在红色通道上使用线性混合蒙太奇方法进行处理，图像尺寸缩小为7.35%。同样的过程用于在3个tma上以20倍和40倍的图像选择内核。为了比较目的，由区域组织实验室捐赠的DAPI染色废弃TMA原型也在荧光成像通道中使用相同的程序在4倍下进行了优化，并包括用于说明TMA的荧光成像。在这种情况下，BioStack 4仍然被使用，但用于从同一Cytation 5成像仪传输单个幻灯片，允许步行成像。

一个x-y偏移、对焦设置、蒙太奇和拼接选项的示例，用于在Cytation 5上以4倍彩色亮场对一批8个不同面板尺寸的tma进行连续成像。

图5。一个x、y偏移量、对焦设置、蒙太奇和拼接选项的示例，用于在安捷伦BioTek Cytation 5上以4倍彩色亮场对一批8个不同面板尺寸的tma进行连续成像。2022世界杯附加赛决赛使用安捷伦BioTek BioStack 4将幻灯片来回传输到成像仪。2022世界杯附加赛决赛

结果与讨论

Cytation 5成像h&e染色tma的能力如下图所示。Cytation 5显微镜模块使用倒置显微镜方向，因此TMA必须通过TMA底部成像，以确保在TMA面板中正确识别核心。因此，载玻片朝向支架，标签朝上。图6显示了24芯样品TMA，而图7显示了使用低分辨率显微镜和4倍物镜对72芯样品TMA成像的能力。

24芯组织芯片在Cytation 5上以4倍的速度成像，使用蒙太奇和Gen5软件中可用的拼接选项。

图6。。24核组织芯片在Agilent BioTek Cytation 5上以4倍的速度成2022世界杯附加赛决赛像，使用Agilent BioTek Gen5软件中提供的蒙太奇和拼接选项。这张幻灯片使用安捷伦BioTek BioStack 4在一批8个混合大小的tma中运行。2022世界杯附加赛决赛(D)使用蒙太奇界面选项显示整个数组以查看所有瓷砖(所有位置模式)。(A,B)在单个平铺视图中显示的数组的两个不同的核心。(A)为81岁女性结肠黏液腺癌III级恶性，(B)为35岁男性癌邻近结肠组织型恶性。由于安捷伦Bio2022世界杯附加赛决赛Tek Cytation 5图像从底部开始，因此将载玻片定位在载玻片支架上的正确方向有利于组织识别，因此最终图像与TMA面板相匹配(C)。在本例中，载玻片在支架上定位，标签朝上。

一个x-y偏移、对焦设置、蒙太奇和拼接选项的示例，用于在Cytation 5上以4倍彩色亮场对一批8个不同面板尺寸的tma进行连续成像。

图7。。人体正常器官组织的72核组织芯片在安捷伦BioTek Cytation 5上以4倍的速度成像，使用蒙太奇和Agilent BioTek Ge2022世界杯附加赛决赛n5软件中提供的拼接选项。这张幻灯片与图6中的数组使用相同的设置在同一批8个混合大小的tma中运行。(B)使用蒙太奇所有位置视图显示整个数组。(A)正常扁桃体组织的核心显示在单个平铺视图中，通过点击蒙太奇控制面板中的单个平铺来选择，或直接双击蒙太奇图像。

图8到图10展示了使用Cytation 5进行更高分辨率显微镜检查的能力，从而实现疾病诊断。最后，图11显示了使用Cytation 5对tma进行荧光显微镜检查的能力。

20倍蒙太奇(上)，显示单个瓷砖的细节区域。

图8。20倍蒙太奇(A)，显示单个瓷砖的细节区域。左侧组织(B)为前列腺恶性肿瘤。图(C)为距离肿瘤1.5 cm的前列腺组织。这些岩心来自两个不同的案子。

默认的拼接重叠设置是不对称的沿着水平行(圈)。

图9。(A)默认的拼接重叠设置是不对称的沿着水平行(圈)。可以自定义平铺重叠值来帮助纠正这个问题。垂直偏移量(列)对齐良好。(B)最佳的2 × 2蒙太奇瓷砖重叠图，以40倍拼接。

从TMA核心拍摄的2 x 2蒙太奇的单个瓷砖的图像。

图10。(A)从TMA核心上以40倍的2 × 2蒙太奇拍摄的单个瓷砖图像。圆圈显示了在组织上使用可区分的标记对每个瓦进行成像的关系。这些是图8所示的2 × 2蒙太奇中单独的4个瓷砖的图像。(B)在左侧显示的4个贴图上使用与motage相同的40倍中心偏移量的单幅图像。该图像位于左下瓦片(圆圈)的标记中心，以说明在相同放大倍率下，使用蒙太奇可以从4个单独的瓦片图像中获得增加的总表面积。

由区域组织实验室捐赠的废弃TMA原型，用DAPI染色，在Cytation™5上使用蒙太奇和Gen5™软件拼接，以4倍成像(上)。

图11。由区域组织实验室捐赠的废弃TMA原型，用DAPI染色，并在Agilent BioTek Gen5软件中使用蒙太奇和拼接在Agilent BioTek Cytation 5上以4倍成像(A)。背景模糊可能是由于不完全2022世界杯附加赛决赛脱亲和造成的。(B)同一阵列以20倍拍摄的单幅图像。(C) h&e染色的正常肺组织，20倍于同一阵列的另一片切片，由独立来源在另一台显微镜上成像进行比较(美国Biomax部件号TH641)。

结论

以下是这项工作的相关结论，证明了安捷伦BioTek Cytation 5和安捷伦BioTek BioStack 4用于高通量组织学应用的h&e染色tma成像自动化工作2022世界杯附加赛决赛流程的能力。

  • 安捷伦BioTek Gen5 v2.07软件中内置的拼接和蒙太奇算法非常适合在任何吞吐量下以彩色亮场和荧光模式对组织微2022世界杯附加赛决赛阵列进行成像。
  • 优化蒙太奇大小，平铺重叠尺寸，x,y偏移和焦点选项增强了定制的图像采集有用的数组相同或不同的大小在单个批处理中运行。
  • 蒙太奇控制面板允许查看整个缝合图像或蒙太奇每个单独瓷砖的特写，允许对染色组织核心进行更详细的检查。单个瓷砖也可以通过直接双击蒙太奇所有位置视图中感兴趣的区域来显示。
  • 在单个协议中包含多个读取步骤的能力允许在多个放大倍数或几何配置下进行并行蒙藏，克服了在更高吞吐量下不同大小或具有不同x、y偏移量的成像阵列的挑战，特别是当需要在更高放大倍数下获得更大表面积的图像时。
  • 来自载玻片下方的细胞5图像，因此为了便于组织ID载玻片在载玻片适配器中应将标签朝上-载玻片置于载玻片支架时朝上的一面应与微阵列面板的几何ID相匹配。
  • 在20x下，15 × 15蒙太奇被发现最适合对1.5 mm核心成像，通过更大的视野提供增强的细节，例如，对恶性组织核心和距离肿瘤1.5 cm的相邻组织核心进行成像。
  • 在40x下，一个2 × 2的蒙太奇提供了4个瓷砖，它们在同一放大倍率下覆盖了一个1.5 mm核心样本部分的更大的视场。如果需要从40倍蒙太奇中获得最终拼接图像，则可能需要自定义平铺偏移来优化平铺重叠对齐。
  • 使用15 × 15蒙太奇网格进行4倍成像，并对每张图像进行自动对焦，自定义x,y偏移量配置为最大阵列，最适合捕获72和24 1.5 mm tma的所有核心。
  • 密度更高的阵列可能需要2.5倍的放大倍数来捕捉单个缝合蒙太奇图像中的所有核心。
  • 通过Cytation 5上可用的任何多模式成像选项，包括明场、彩色明场、相位对比、数字相位对比和荧光，这里显示的技术可以在许多显微镜载玻片应用中使用固定的人类或动物细胞系、单个组织切片、部分或整个标本放置，或细菌，例如酵母涂片。

参考文献

  1. www.biomax.us
  2. https://www.fda.gov/medical-devices/guidance-documents-medical-devices-and-radiation-emitting-乐鱼平台入口products/guidance-submission-immunohistochemistry-applications-food-and-drug-administration-final-guidance

链接