聚合β-淀粉样蛋白对阿尔茨海默病记忆关键细胞信号通路影响的分析

作者:布拉德•拉森安捷伦科技有限公司;阿图罗Gonzalez-Moya,Cisbio；Alexandra Wolff, Wini Luty，恩佐生命科学

简介

细胞外信号调节激酶(ERK)信号与记忆有关，并受环境刺激的调节，而进行性认知损伤是阿尔茨海默病的典型特征。这种缺陷被认为是由聚集的β-淀粉样肽1-42 (Aβ)引起的进行性突触功能障碍的结果。例如，研究表明，Aβ诱导破坏对记忆至关重要的激酶。¹此外，在阿尔茨海默病晚期，相对于早期和对照组，ERK激活被抑制。²最后,在体外研究表明，在一定条件下，Aβ或片段在神经元细胞模型中抑制ERK或下游cAMP反应元件结合蛋白(CREB)。^3.

本应用说明书评估了SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞系检测Aβ治疗后ERK和CREB磷酸化水平变化的能力。a β使用先前发表的方法被寡聚。⁴采用两步HTRF分析过程，在96孔透明底成像板上进行细胞电镀和处理。裂解后，将等分液转移到分离的小体积384孔分析板上进行磷酸化和总ERK和CREB测定。我们还测试了一种中和抗体的能力，以抵消Aβ的抑制作用。通过免疫荧光和显微分析检测Aβ结合和抗体中和。所有的微孔板读取和细胞成像步骤都是使用一种新型的细胞成像多模式阅读器进行的。该组合提供了一种有效、可靠的方法来测试新分子，以对抗疾病的退行性影响。

HTRF磷酸化和总蛋白测定原理

Cisbio Bioassays的HTRF检测结合了荧光共振能量转移(FRET)和时间分辨荧光(TRF)以消除背景干扰，并基于三明治免疫分析原理(图1)。在细胞膜裂解后，加入两种单克隆抗体可检测磷酸化和总蛋白:一种是抗磷酸化蛋白k(磷酸化)抗体，一种是抗蛋白k(总蛋白)抗体，标记为Eu^{3 +}隐窝蛋白和d2标记的抗蛋白d2抗体。在磷酸化或总蛋白存在的情况下，并在Eu的激发下^{3 +}能量转移到d2分子，并在665 nm处可见到增加的发射。在没有蛋白质的情况下，没有能量转移，几乎没有665 nm的信号被检测到。

图1所示。HTRF磷酸化和总蛋白测定。两板HTRF Human ERK和CREB蛋白测定分三步进行。(A)细胞与调制器孵育。(B)细胞被裂解，释放磷酸化和非磷酸化的蛋白质。(C)细胞裂解液转移到第二个平板，然后加入抗体和读板。

材料和方法

材料

分析和实验成分

Advanced phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)细胞检测试剂盒(部分编号64AERPEG)， ERK Total Kit(部分编号64NRKPEG)， CREB phospho-S133 Kit(部分编号64CREPEG)和CREB Total Kit(部分编号63ADK052PEG)由美国Cisbio Bioassays (Bedford, MA)捐赠。

冻干β-淀粉样蛋白(1-42)肽(部分编号ALX - 151 - 002-P001)、β淀粉样蛋白A4 (CT, 1-42)单克隆抗体(8G7)(部分编号ADI-905 - 804 - 100)和山羊抗小鼠IgG1 (ATTO 590偶联物)(部分编号ALX - 211-204TM-C100)均由Enzo生命科学(Farmingdale, NY)捐赠。

氢氧化铵溶液(零件号338818)购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO)。SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞(零件号CRL-2266)购自美国弗吉尼亚州马纳萨斯ATCC公司。低聚物A11抗体(部分编号AHB0052)购自ThermoFisher (Waltham, MA)。纯化的抗-β-淀粉样蛋白1-16抗体(部分编号803001)购自BioLegend公司(San Diego, CA)。

2022世界杯附加赛决赛安捷伦BioTek Cytation 5细胞成像多模读取器

Cytation 5细胞成像多模读取器将模块化多模微孔板读取器与自动化数字显微镜结合在一个紧凑的单元中。滤镜和单色基微孔板读取，显微镜模块提供高达60倍放大荧光，亮场，颜色亮场和相位对比。该仪器在一个步骤中可进行多达四个通道的荧光成像。Cytation 5特别强调活细胞分析，温度控制到65°C, CO₂/ O₂气体控制和双注射器的动力学分析。集成的安捷伦BioTe2022世界杯附加赛决赛k Gen5数据分析软件控制Cytation 5，并用于初始数据分析。成像模块用于显示肽结合对细胞的影响，而基于过滤器的系统用于检测HTRF磷酸化和总蛋白检测的665和620 nm荧光发射。使用以下设置:板移动后延迟:0毫秒;激发后延迟:150 μsec;集成时间:500 μsec;读取高度:7.5 mm。

其他设备

汉密尔顿气密注射器，1700系列(部分编号81175，汉密尔顿公司，雷诺，NV)。

方法

低聚肽过程

将冻干的β-淀粉样肽(1-42)置于1%氢氧化铵中重悬，浓度为1 mg/mL，超声1分钟。使用Hamilton Gastight注射器将体积平均分配到三个聚丙烯小瓶中，然后密封，在室温下孵育超过2小时，以允许单体化。然后将每个小瓶中的溶液在室温下用真空浓缩离心机浓缩800g。这些小瓶现在含有肽膜，然后储存在-80°C。然后，薄膜在1 mM的100% DMSO中重悬，超声10分钟，并在-20°C保存。为了完成齐聚，将小瓶从仓库中取出，在无菌磷酸盐缓冲液中稀释至500 μM，在4°C孵育24小时。

试验过程

细胞板:SH-SY5Y细胞以浓度为2.0 × 105 cells/mL，体积为100 μL，置于96孔显像板上，37℃/5% CO孵育₂直到达到80%的融合度。在此期间，每两天进行一次媒体交流。

Oligomerized肽治疗:寡聚β-淀粉样蛋白(1‑42)肽在无血清DMEM/F12培养基中稀释至1倍浓度，浓度范围为10 ~ 0 μM。将培养基完全从孔中取出，替换为含有肽的培养基，随后与细胞孵育2、6、12或24小时。

抑制剂抗体之外:从孔中完全去除培养基，用A11或抗β-淀粉样蛋白，1-16抗体，5倍浓度，1000 - 0 ng/mL, 20 μL, 37℃孵育30分钟。然后将寡聚肽以80 μL的体积加入到最终浓度为10 μM的1倍溶液中，按照上述方法孵育。

成像:在初始细胞板上，首先完成细胞固定和通透性，然后进行初级淀粉样蛋白β和二级ATTO 590 IgG1抗体孵育。利用DAPI通道，利用Cytation 5对Hoechst 33342染色细胞核进行荧光成像;Alexa Fluor 488 phalloidin染色actin的GFP通道;和Texas Red从ATTO 590山羊抗小鼠IgG1二抗体中捕获信号。

细胞分析:进行了两次单独的细胞分析。第一种方法是确定每个20x图像的细胞数量。利用利用DAPI通道捕获的Hoechst 33342染色细胞核发出的信号，Gen5对主要和高级细胞参数进行了优化，以自动在阱中的每个细胞核周围放置物体掩模。然后进行第二次分析，以量化同一图像中寡聚β-淀粉样肽结合位点的数量。利用得克萨斯红通道捕获ATTO 590二抗的荧光。细胞分析参数再次优化，以准确地识别较小的、精确的结合区域。最后，将每张图像识别的结合位点总数除以核数，使每个处理条件下β-淀粉样肽结合的数量归一化。

HTRF试验性能:去除含肽或肽和抗体的培养基，用80 μL裂解缓冲液取代，室温摇板60分钟。其余的测定步骤按照图1所示进行。

结果与讨论

β-淀粉样蛋白与SH-SY5Y细胞结合

首先，通过上述步骤验证了寡聚β-淀粉样蛋白(1-42)肽与SH-SY5Y神经元细胞模型的结合能力。然后按照前面描述的方法进行免疫荧光，然后使用20x或40x物镜进行成像。

如图2所示，寡聚的β-淀粉样蛋白(1-42)肽与SH-SY5Y细胞结合，可被纳入的一抗和二抗检测。结合以剂量和时间依赖性的方式发生，如图3所示，其中进行了细胞分析，以确定每个测试孔中每个细胞的淀粉样蛋白结合位点的平均数量。

图2。β淀粉样肽绑定。重叠图像显示24小时孵育后β-淀粉样肽与SH-SY5Y细胞结合。40x图像显示(A) 0 μM孵育;或(B) 10 μM肽。DAPI通道:Hoechst 33342染色细胞核;GFP通道:Alexa Fluor 488 phalloidin;德州红:atto590山羊反兔IgG1。

图3。时间和剂量依赖性β-淀粉样肽与SHSY5Y细胞的结合在β-淀粉样肽浓度为10,000、2500和500 nM处理2、6、12或24小时后，确定了结合位点。

β-淀粉样蛋白阻断ERK-CREB信号

验证β-淀粉样肽结合后，确定结合是否会干扰导致ERK和CREB磷酸化的信号通路，如前所述。^3.第二板采用与前面描述类似的方法，用寡聚β-淀粉样蛋白(1-42)肽处理。肽和裂解缓冲孵育后，四组液体转移到384孔板的小体积孔中，每个孔包含4个16 μL等分，肽浓度为10,000 - 50 nM。使用一组分别进行HTRF高级磷酸化erk1 /2 (Thr202/Tyr204) (pERK)测定、ERK总蛋白测定、CREB磷酸化s133 (pCREB)测定或CREB总蛋白测定。计算与未处理细胞相比的总蛋白浓度，以及与总蛋白相比磷酸化蛋白百分比，在每个时间点测试β-淀粉样蛋白(1-42)肽的浓度(图4)。

虽然总蛋白水平未受寡聚β-淀粉样肽(1-42)处理的影响，但磷酸化蛋白水平随着β-淀粉样肽浓度的升高而成比例下降，并随着pERK和pCREB检测的孵育时间的增加而增加(图4)。

图4。磷酸化蛋白水平的时间依赖性百分比。磷酸化蛋白在10000、2500和500 nM的肽处理后表达，与SH-SY5Y细胞孵育2、6、12或24小时后，每个样品的总蛋白水平的百分比。(A) pERK报告结果;和(B) pCREB测定。

中和β-淀粉样蛋白结合

抗体，如寡聚物A11抗体，显示了免疫中和β-淀粉样肽寡聚物的能力，从而恢复信号通路活性。通过使用test A11抗体以及阴性对照抗β-淀粉样蛋白抗体1-16(已知无中和作用)处理SH-SY5Y细胞来检测这一现象以及跟踪后续细胞活性变化的能力。在37°C与抗体孵育30分钟后，用10 μM多肽处理细胞2、6、12或24小时。再次进行免疫荧光，然后使用20x或60x物镜进行荧光成像(图5)。

图5．中和β-淀粉样肽结合。重叠图像显示抗体作用于与10 μM β-淀粉样肽结合的SH-SY5Y细胞24小时后。60x图像显示与(A) 0 ng/mL或(B) 1000 ng/mL A11抗体孵育。20x图像显示与(C) 0 ng/mL A11抗体和0 μM肽(阳性对照)孵育;(D) 0 ng/mL A11抗体和10 μM肽;(E) 1000 ng/mL抗-β-淀粉样蛋白，1-16抗体和10 μM肽;(F) 1000 ng/mL A11抗体和10 μM肽。DAPI通道:Hoechst 33342染色细胞核;GFP通道:Alexa Fluor 488 phalloidin; Texas Red: ATTO 590 goat anti-mouse IgG1.

对比图5C和图5B (60x)、图5F (20x)阳性对照图，证实抗体处理使与SH-SY5Y细胞结合的β-淀粉样寡聚肽发生免疫中和作用。抗β-淀粉样蛋白1-16抗体治疗后未见中和作用，证实了特异性A11抗体的作用(图5E)。在查看图5中的60倍图像时，这一点得到了特别的证明。在没有抗体治疗的情况下可以看到高水平的肽结合，在与A11抗体孵育时几乎完全中和。通过对20x图像的细胞分析来计算每个细胞的β -淀粉样蛋白结合位点，可以证明中和效应是时间和剂量依赖性的(图6)。

图6。20x图像的细胞分析显示，在A11或抗β-淀粉样蛋白1-16抗体之后，β-淀粉样蛋白肽与SH-SY5Y细胞结合。

最后，在A11和抗β-淀粉样蛋白、1-16抗体处理后，再次计算磷酸化蛋白相对于总蛋白的百分比。ERK和CREB磷酸化水平增加到含有未处理细胞的孔中，证实了免疫中和修复了被寡聚β-淀粉样肽结合受损的信号通路(图7A和B)。由于抗β-淀粉样蛋白1-16抗体处理后磷酸化水平没有改善，这一效应也被证实是针对A11抗体的。

图7．磷酸化百分比与总蛋白水平的抗体和β-淀粉样肽处理。与A11抗体浓度为1000 - 0 ng/mL，孵育2、6、12或24小时的总蛋白值相比，磷酸化蛋白百分比。此外，经1,000 ng/mL抗-β-淀粉样蛋白、1-16抗体和10 μM肽处理的孔以及阳性对照未处理孔的值也有报道。(A) pERK/总ERK报告结果;及(B) pCREB/总CREB。

结论

来自Enzo Life Sciences的β-淀粉样蛋白(1-42)肽、β淀粉样蛋白A4 (CT, 1-42)单克隆抗体和山羊抗小鼠IgG1 (ATTO 590偶联物)二抗是灵敏的工具，用于复制和监测β-淀粉样蛋白结合在体外设置。Cisbio Bioassay的HTRF磷酸化和总蛋白分析可以方便地确定特定目标的肽结合效应。可以从同一井中评估多个目标，从而减少板块之间的差异。此外，安捷伦BioTek Cytation 5结合了基于过滤器的微孔板读取、荧光成像和图像分析，以及集成的安捷伦BioTek Gen5数据分析软件，使样品处理和计算可以在单个仪器中进行。2022世界杯附加赛决赛最后，结合微孔板读取和成像，以及分析方法，创造出强大的在体外方法来做出表型和基于目标的决定，可以进一步了解阿尔茨海默病及其影响如何可以抵消。

参考文献

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