使用混合Agilent BioTek Synergy 4多模式微板阅读器定量人胰岛素2022世界杯附加赛决赛

作者: Paul Held博士，安捷伦科技有限公司

摘要

糖尿病是一种在美国流行的疾病。胰岛素在调节血糖水平方面起着关键作用。在正常情况下，朗格汉斯胰岛β细胞对其产生和分泌有严格的调控。在糖尿病研究中，潜在药物化合物治疗后的血清或血浆样品中胰岛素水平的定量是一项必不可少的程序。在这里，我们描述了使用安捷伦BioTek Synergy 4多模2022世界杯附加赛决赛式微板阅读器使用AlphaLISA法定量胰岛素。

简介

放大发光接近均相分析(AlphaLISA)使用涂有一层水凝胶的活性供体和受体珠，这允许它们与生物分子结合(图1)。在激发下，供体珠中的光敏剂将环境中的氧气转化为活性单线态氧。供体珠中光敏剂的高浓度可导致每秒产生多达60,000个单线态氧分子，并可作为显著信号放大的手段。单线态氧与受体珠中的硫氧烯化合物反应，产生发出370nm的化学发光信号。能量立即转移到包含在同一受体珠中的荧光团，这有效地将发射波长转移到520到620纳米。由于单线态氧是不稳定的，平均寿命约为4 μ秒，它只能扩散200 nm的距离后才会衰变。距离限制确保了在两个珠之间没有特定的生物相互作用时，供体珠产生的单线态氧将不会被检测到。不在这个距离内的接受珠不会发光。

人胰岛素试验使用两种不同的抗胰岛素单克隆抗体使供体和受体珠靠近。AlphaLISA受体珠与8E2抗人胰岛素抗体结合，可以结合并捕获样本中的任何人胰岛素。生物素化的3A6抗人单克隆抗体通过结合胰岛素-受体珠复合物和供体珠与链菌亲和素包被的供体珠形成桥梁(图1)。

图1所示。人胰岛素AlphaLISA试验示意图。

材料与方法

一个人胰岛素检测试剂盒，包含AlphaLISA受体珠、AlphaLISA供体链菌亲和素珠、人胰岛素和生物素化抗人胰岛素抗体，是Perkin Elmer (Boston, MA)的慷慨礼物。纯白色384孔微孔板(零件号3705)来自康宁公司(Corning, NY)。

使用测定缓冲液作为稀释剂进行一系列从0到400 μ IU/mL的人胰岛素稀释。测定缓冲液为30 mM Tris pH 7.4, 0.5% Triton X-100, 0.1% BSA。以测定缓冲液为稀释剂，制备含有生物素化抗人胰岛素- 3a6抗体(2.5 nM)和抗胰岛素8E2抗体包被受体珠(25µg/ml)的主混合物。用测定缓冲液稀释链霉亲和素包被供体珠80µg/mL。将5µL胰岛素稀释剂添加到384孔微孔板的孔中，重复8次，然后向所有孔中添加20µL主混合液，制备反应。

在室温下孵育30分钟，然后加入25µL稀释的供体珠溶液。完整的反应混合物除人胰岛素稀释剂外，还含有1nm生物素化3a6抗体，10µg/mL受体珠和40µg/mL供体珠。反应在黑暗中孵育60分钟，AlphaLISA信号使用Synergy 4多模微板阅读器确定。使用Agilent BioTek控制阅读器，收集和分析数据2022世界杯附加赛决赛Gen5数据分析软件。

结果与讨论

图2显示了胰岛素浓度与AlphaLISA信号的关系。这种关系可以用数据的4参数逻辑拟合来最好地描述。该方法直接量化胰岛素浓度，因此AlphaLISA信号随着胰岛素浓度的增加而增加。

图2。人胰岛素浓度曲线。使用安捷伦BioTek Gen5数据分析软件对人胰岛素滴定产生的AlphaLISA信号与胰岛素浓度进行绘制，并对数据进行logistic 4参数最佳拟合。2022世界杯附加赛决赛

通过使用“缩放”功能的Gen5数据分析软件，一个可以检查信号低胰岛素浓度。如图3所示，即使胰岛素浓度很低，数据的逻辑拟合也显示出与真实数据的良好关系。该方法的检出限通过计算0标准以上的3倍标准偏差的校准曲线确定。然后用这个值来插值校准曲线。最低检出限为平均值2.8 μ IU/mL或120 pg/mL。

图3。低胰岛素浓度滴定。图2中显示的数据进行了扩展，以演示低浓度下的校准曲线。绿色线表示AlphaLISA信号和计算出的检测限浓度。

本应用说明描述了使用AlphaLISA检测技术对人胰岛素的定量研究。与传统的ELISA不同，AlphaLISA是一种均相检测，不需要任何分离或洗涤步骤。由于不需要任何分离步骤，AlphaLISA检测不仅可以节省大量的时间和试剂费用，而且还提高了检测的易用性和简单性。由于不需要清洗步骤，均质分析也可以更容易地移动到更高基质的微孔板(例如1536孔)。

AlphaLISA受体珠与链霉亲和素包被供体珠结合提供了一种简单的方法，可以开发基于抗体检测的任何生物标志物检测。基本要求是有两种针对分析物的特异性抗体。一种抗体共价附着在AlphaLISA受体珠上，另一种是生物素化的，这两种方法都是简单有效的。

这些数据证明了安捷伦BioTek Synergy 4混合阅读器执行AlphaLISA分析的能力。2022世界杯附加赛决赛通常，设计用于运行AlphaLISA检测的设备是非常昂贵的专用仪器，利用激光产生兴奋光。单色激光提供连续的光输出，以及波长特异性，这两者都是AlphaLISA分析所必需的。氙气闪光灯通常用于多模微板阅读器，因为它们可以在宽波长范围内提供光输出，但也可以根据时间分辨测量的要求迅速停止照明。不幸的是，闪光灯不能提供AlphaLISA检测所需的连续照明。闪光之间的时间可以使兴奋性反应减弱。与大多数多模微板读取器不同，安捷伦BioTek Synergy 4同时具有恒定的钨卤光源和氙2022世界杯附加赛决赛气闪光灯。这种多光学设计能够提供连续的激发光源，波长特异性和高灵敏度，这些分析需要运行。