2018年7月3日
简介
最近，我们对各种形式的核糖核酸(RNAs)所起的作用的认识有了巨大的转变。在以细胞为基础的生物中，各种RNA通过各种生物途径执行新的活动，包括调控RNA，如miRNAs、siRNAs、piRNA和CRISPR RNA，以及与翻译(mRNA、tRNA和rRNA)和RNA加工(snRNA和snoRNA)相关的更传统的RNA。为了更好地理解rna所发挥的多方面作用，人们对研究工作的兴趣不断增加。许多实验系统的一个核心要求是在使用前对RNA进行定量。有几种方法可以量化RNA，包括使用RNA在紫外线波长范围内对光的固有吸收，以及在可能存在污染物种时允许更高灵敏度和特异性的增强试剂。
方法
紫外吸收
所有核糖体RNA标准品都是通过在TE缓冲液(tris-EDTA, pH=7.0)中制备1:2系列稀释浓缩液来制备的。在100 μL的紫外透明微孔板中，在260 nm处进行吸光度测量，分三次。
荧光分析
quantum - it™RiboGreen试剂，型号# R11490，购自thermofisher。96孔黑色微孔板(cat # 3915)来自康宁。以TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5)为稀释剂，将核糖体RNA稀释至2 μg/mL。最终浓度用260 nm吸光度确定。使用TE和100 μL等分液移液管到微孔板中进行一系列稀释，稀释范围为~0.0 ~ 3200 ng/mL或0.0 ~ 100 ng/mL的纯化RNA。取等量(100 μL)工作RiboGreen定量试剂，室温避光孵育10分钟。将DMSO-Ribo- Green原液按制造商推荐的1:200用TE稀释制备工作RiboGreen试剂。荧光测定用a协同™LX带GFP滤波器立方体的多模阅读器(EX 485/20 nm, EM 528/25 nm和510 nm截止二向色镜)。浓度报告为最终测定量中的浓度。
结果与讨论
紫外吸收仍然是估计核酸浓度的最常用方法，主要是由于易于使用。主要关注的是由于具有相同吸收峰的污染物种而造成的高估。此外，吸收方法可能会受到较高的检测限制，这在处理亚微克/毫升范围内的样品时最为显著。然而，紫外吸光度提供了在相对较大的浓度范围内的纯化RNA的快速估计，通常由许多实验室制剂产生(图1)。
图1所示。RNA吸光度测量。在TE缓冲液中制备了0 - 3,200 ng/mL的核糖体RNA稀释系列。标准品在100 μL的紫外透明96孔微孔板中分析，一式三份。
使用荧光互色染料可以有效地精确定量低浓度样品，如下图所示。开发这些染料是为了能够区分不同的生物分子，在某种程度上，还可以区分不同的核酸种类。通过将试剂浓度分别调整为200倍或2000倍稀释，RNA检测可以以高范围或低范围格式运行(图2和图3)。高范围和低范围检测的计算检测限分别为0.5和1.7 ng/mL，几乎相同。
图2。高量程荧光测量。在TE缓冲液中制备了0 - 3,200 ng/ mL的核糖体RNA稀释系列。标准品在标准96孔微孔板中以100 μL的体积分析，一式三份。
图3。低距离测量。在TE缓冲液中制备了0 - 100 ng/mL的核糖体RNA稀释系列。标准品在标准96孔微孔板中以100 μL的体积分析，一式三份。
结论
Synergy™LX多模式阅读器提供了生物研究中最常用的检测技术，包括吸收，荧光和发光检测。在这里，我们展示了它的实用性，使用紫外检测和各种比色测定来量化蛋白质，以扩大可测量浓度的动态范围，并对许多干扰化合物具有耐受性。