2018年5月31日
简介
多达三分之一的假定药物因毒性问题而失败，这导致了药物研发的高昂成本，特别是在毒性在临床试验中得到证实的情况下。因此，小分子的毒性测试通常在临床前使用基于细胞的体外试验作为确定任何毒性问题的第一步。有许多商业化的检测技术可用于探测不良影响导致检测信号下降的细胞活力。这些测定方法通常是为使用微板和典型的微板阅读器光学检测的工作流程而设计的。在本技术简报中，我们展示了其中三种细胞活力技术，它们使用吸收、荧光或发光检测，均以低成本测量协同™LX多模的读者。
材料和方法
毒性实验
人前列腺癌细胞株(PC-3)细胞在添加10%胎牛血清和青霉素-链霉素的Hams F12K营养液中培养，37℃，5% CO2．培养物在80%汇合时常规胰酶化(0.05%胰蛋白酶- edta)。
细胞株用不含酚红的DMEM/ F12培养基镀至康宁3904黑边透明底96孔微板上，每孔100 μL总细胞数为30000。培养24小时后，以100 μL的浓度分别加入细胞毒性化合物环己酰亚胺和他莫西芬。暴露24小时后，取100 μL细胞培养液，按以下要点加入稀释试剂。
肝癌和比色测定
加入10 μL 12 mM Vybrant™MTT细胞增殖试验试剂(Life technologies, cat # V 13154)。反应在37°C的潮湿环境中进行4小时。在0.01 N HCl溶液中加入100 μL 10% SDS, 37℃湿化16小时，停止反应，使不溶性福马甲溶解。在570 nm处测定吸光度协同LX多模式阅读器(BioTek Instruments, Winooski, VT)使用专用的UV-Vis单色仪。
荧光钙黄素AM测定
加入100 μL的5 μM Calcein AM (Life technologies, cat # C34852)。细胞在37°C孵育30分钟，之后使用使用绿色荧光立方体的Synergy LX测定荧光。绿色荧光立方体配置了一个485/20激励滤波器，一个528/20发射滤波器，和一个510 nm的截止二色镜。
发光CellTiter-Glo®化验
加入重组CellTiter-Glo细胞活性试剂(Promega cat # G7572) 100 μL。在轨道摇床上摇2分钟，然后在Synergy LX阅读器中室温下在黑暗中孵卵10分钟，然后使用带有专用发光立方体的Synergy LX进行发光测定。这个立方体允许光从微孔板直接通过到PMT探测器。使用默认设置的PMT增益(135)和收集时间(1秒)。
细胞滴定实验
在细胞滴定实验中，PC-3细胞浓度范围可达36,000个/孔。24小时后，根据制造商的规格添加试剂，并使用上述检测模式在Synergy LX上读取。
结果与讨论
每一种被测试的试剂都探测细胞健康，尽管方法不同。比色MTT法依靠内源性NAD(P)H氧化还原酶将MTT还原为彩色福马甲染料;钙黄素AM试剂由内源性细胞质酯酶从非荧光化合物转化为荧光化合物;CellTiter-Glo是基于ATP的量化，这表明存在代谢活跃的细胞。因此，对于每种试剂，随着存活细胞的增多，检测信号就会增大。这在图1中很明显地展示了每种检测技术的细胞滴定。
图1所示。比色MTT，荧光钙黄素AM和发光CellTiter-Glo的细胞滴定曲线。所有数据均归一化为每种检测技术的最大信号。每个数据点代表平均8个重复。
在毒性实验中，在添加小分子化合物后探测细胞健康，如果化合物显示毒性，人们会期望每种检测技术的信号减少。减少的程度取决于参与产生信号的特定酶如何受到影响，或在ATP测量的情况下细胞的代谢活性。图2显示了细胞经环己酰亚胺和他莫西芬处理后的这些影响。
图2。A)比色MTT法测定化合物环己酰亚胺和他莫西芬的剂量响应曲线;B)钙黄素AM荧光测定法;C)发光CellTiter-Glo试验。信号表示为阴性对照的百分比。每个数据点代表平均8个重复。
环己酰亚胺在生物医学研究中被广泛用于抑制体外真核细胞的蛋白质合成。它的毒性作用在图2中可以清楚地看到，在每种技术中，随着化合物剂量的增加，信号明显显著下降。对于每种技术，在最大信号降的一半处的剂量约为0.1 μM。还需要注意的是，与ATP测量(CellTiter-Glo)相比，基于胞质酶翻转(MTT和钙黄蛋白AM)的检测技术的细胞毒性程度似乎更大。相反，它莫西芬在全剂量范围内几乎没有毒性，这对于这种广泛用于治疗乳腺癌的药物来说并不意外。
结论
Synergy™LX多模式阅读器是一种低成本的解决方案，适用于生命科学研究中使用的最常见的检测技术，包括吸收、荧光和发光检测。在这里，我们展示了它在量化细胞毒性方面的效用，使用广泛使用的细胞活力测定，采用这些常见的检测模式。