2021年4月8日
简介
在过去的十年里，我们见证了在三维环境中培养的各种来源的细胞和组织的使用的爆炸式增长，从而产生了更复杂的生物模型。这些3D模型在医学研究、精确医学、疾病建模和药物发现等领域的应用一直在增加。这些模型倾向于代表在生物中发现的原生微环境，并被认为在某些情况下提供了更准确的分析模型。人们经常将3D模型与广泛使用的二维(2D)模型进行比较，后者由单层细胞组成，已经使用了几十年。二维分析的使用提供了有意义的数据，但局限性变得明显，近年来，由一种或多种细胞类型组成的复杂类器官、组织或类肿瘤的开发，通常基于干细胞或患者提取的样本，已成为许多研究的焦点。
考虑到许多实验室的试验台空间有限，在单一仪器上以较小的占地面积执行多种分析类型的能力是有利的。安捷伦B2022世界杯附加赛决赛ioTek2022世界杯32强赛程表时间
共聚焦成像阅读器可以在单一仪器上进行微板阅读、宽视场成像以及共聚焦成像，为当今许多复杂研究提供了一种收集广泛数据的手段。本应用简报描述了一种自动成像分析方法的使用，用于精确测定球形细胞数，以评价药物剂量反应。
材料与方法
HCT116-H2B-GFP细胞由佛蒙特大学的Stumpff实验室提供。在活细胞分析中，H2B-GFP结构提供了一个细胞计数定量表达的核标记，用于与核染色进行比较。细胞在96孔的圆底ULA成像板(零件号4520)中以500个细胞/孔的相对较低密度进行播种，并根据条件允许生长3 - 4天。这导致了大约100 μm大小的球体。作为已知的凋亡诱导剂，添加了有效的，非选择性的蛋白激酶抑制剂，staurosporin。同时加入碘化丙啶(PI)进行动力学监测，以确定最佳分析时间。结果表明，添加12小时后足以显示显著的凋亡活性。
图1所示。椭球体分析工作流程，包括自动图像采集和分析与cyation C10共聚焦成像阅读器和Gen5微刻版阅读器和成像仪软件。
成像程序与分析
球体的大小是有意的，当使用20x物镜时，允许在单个视场中捕获整个物体，以最小化数据集的大小。此外，还使用信标来解释井内球体x-y定位的任何变化，以保持单一视场。在共聚焦成像中，60 μm针孔旋转盘在采集时间和信号强度之间提供了最佳的折衷方案。在GFP和TRITC通道中捕获宽视场图像与共焦图像进行比较。
使用的聚焦方法是“扫描”，然后是“自动聚焦”。这种聚焦方法确定了椭球体沿z轴的近似中心，并允许每个椭球体在10 μm处用11步捕获z-堆栈，而不管z在微孔板中的位置。这些图像服从几个处理步骤，包括一个用于比较椭球体近似中心的单个z平面图像的z投影，以及用于两种成像模式的整个z堆栈。
图2。以z-堆栈的方式以10 μm的间隔进行11步捕获。对所有图像的z投影或通过椭球体近似中心表示平面的单幅图像进行分析。
使用共聚焦和宽视场成像模式进行自动细胞计数，并对单平面和z叠投影图像进行分析。
图3。使用z投影图像的共聚焦和广角荧光显微镜对球状体进行自动图像采集和细胞计数分析的代表性例子。细胞掩蔽用黄色轮廓表示，其中GFP细胞计数表示活细胞，PI表示死细胞。
图4。电子商务50每种成像模式的确定，单投影和z投影图像。
结论
球体越来越多地被用来表示生物系统所指示的更复杂的微环境。使用多种成像模式自动捕获图像并执行自动图像分析的能力可以显著提高吞吐量并允许进行比较分析。与宽视场光学相比，共聚焦光学能够更精确地分割球体样品中的标记细胞。使用单一z平面图像确定细胞计数的方法与依赖z堆栈图像采集和处理的方法具有可比性。该研究提供了Agilent BioTek Cytation C10共聚焦成像读取器和Agilent BioTek 2022世界杯附加赛决赛Gen5微板读取器和成像软件的灵活性的一个例子，使用单一的、紧凑的仪器捕获和分析多个并行数据集，以帮助简化分析开发和优化。
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