高通量筛选应用

简介

20多年来，高通量筛选(HTS)一直是药物发现过程的一部分，该过程是对小分子化合物库进行单独的结合、激活或灭活药物靶分子生物活性的评估。它的主要目的是快速选择具有所需活性的化合物，从而进行进一步的测试和优化。自建立以来，高温检测技术已经发生了重大变化:早期依赖于“自制”的分析化学试剂和基础研究仪器，现在发展为工业化方法，包含数百万种化合物，可以通过复杂的液体处理、检测和机器人技术对纯化药物靶点进行筛选。

HTS市场依然强劲，占全球药物发现技术市场的35%，预计到2017年将达到199亿美元¹．然而，制药行业面临着降低药物发现过程成本和提高筛选活动中真正先导化合物数量的压力;最终成为一种上市药物。这种压力已经导致整个行业的高温运输方式发生了转变。今天，HTS方法已经脱离了“工业化”的重点，采用了“更智能的筛选”的原则。筛选活动通常不再涉及数以百万计的化合物，而是使用专门的文库，不仅提供多样性，而且提供感兴趣基因家族的已知药效团。使用纯化药物靶点的生化分析正在被涉及细胞的功能和表型分析所取代。今天使用的一些表型分析包括实时细胞反应的动力学监测。此外，具有过表达药物靶点的永生细胞系反过来被使用具有内源性表达药物靶点的人原代细胞所取代。为HTS运动寻找足够数量的人类原代细胞的问题开始通过使用诱导多能干细胞来解决²．

智能筛选还扩展到用于高温超导的仪器。液体处理和检测仪器必须能够执行来自生化和基于细胞的检测程序的许多高级任务，使用各种检测模式提供准确、高效和可重复的结果。BioTek Instruments了解HTS的发展，并设计了仪器，以促进在今天的HTS实验室中运行的更智能的屏幕。在接下来的章节中，我们将描述BioTek用于高温超导方法的液体处理和检测仪器，并提供四个高温超导案例研究。案例研究使用了商用的化合物库和适合于核受体、GPCR、细胞激酶以及表观遗传药物靶点的检测化学物质。

BioTek仪器

MultiFlo™微板分配器

MultiFlo™微板分配器将“多个”分配器组合在一个紧凑的单元中，从而减少了总体仪器成本、机器人占地面积、调度复杂性和处理时间。其独特的平行分配技术结合了两个八尖，非接触式蠕动分配器和两个可变管注射器泵分配歧管，以最大限度地提高96-，384-和1536孔微板的分析灵活性。对于使用细胞为基础的分析，MultiFlo的分配线和歧管可以通过化学手段或高压灭菌。当以独立模式用于无菌点胶时，该仪器也可以放置在层流罩中。在这里详细介绍的分析中，MultiFlo被用于分配细胞和培养基，其他检测组分，检测试剂到384-和低体积384-孔(LV384)格式的分析孔。

EL406™Microplate Washer Dispenser

EL406™Microplate Washer Dispenser结合了快速，完整的Microplate洗涤，连同一个单一的八尖，非接触式蠕动分配器和两个变量管注射器泵分配器歧管在一个紧凑的单元。因此，通过减少多个专用仪器的费用和维护，节省了宝贵的工作台空间，简化了板调度程序，提高了流程运行速度。该仪器也非常适合用于基于细胞的分析，提供与MultiFlo相同的杀菌能力和小的占地面积。此外，洗涤歧管的吸吸功能，结合三个分配器中的任何一个，提供了快速，准确的介质交换和缓冲洗涤。在这里详细介绍的分析中，EL406被用于分配细胞和培养基，吸取培养基和执行缓冲清洗，并分配检测试剂到96孔和384孔格式的分析孔。

Precision™微板移液系统

Precision™微板移液系统在一台仪器中结合了一个8通道移液头和一个8通道散装试剂分配器。使用无菌一次性针尖，结合小的占地面积，使Precision可以插入生物安全柜，并与基于细胞的分析一起使用，执行常规程序，如稀释或连续滴定。对于这里描述的项目，该仪器被用来稀释库化合物，创建化合物剂量响应曲线用于验证和二次筛选，并将所有化合物转移到96孔或384孔的分析板上。

Synergy™多模式Microplate阅读器

BioTek的Synergy™多模式微板阅读器系列非常适合当今筛选实验室的需求。对于小分子的高通量筛选等应用，Synergy Neo是最佳选择。对于更小的小分子文库筛选或生物治疗药物发现等应用，Synergy H1是一个更具成本效益的选择。两种微板阅读器均采用滤光立方体和最小的光学元件(无光纤)，以确保高透光率和高灵敏度。它们还结合了BioTek的专利混合技术™，提供了单色系统或过滤器/二色镜系统的灵活选择检测。

协同™Neo

Synergy Neo是专为当今HTS实验室所需的超高性能微板检测而设计的。对于双发射分析，如时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)，该装置采用了滤片立方体设计，允许使用双光电倍增管(PMT)同时测量供体和受体荧光，其中一个是红移PMT，对远红光谱发射具有高灵敏度(图1A)。对于发光，较低激发立方体的一侧是空的，以允许发光信号的传输。顶部发射立方体包含一个二色镜，将信号导至低噪声PMT(图1B)。TR-FRET和发光分析的配置可以使用相同的激发和发射滤波器立方体来完成。光路没有限制光传输的组件，如光纤电缆，因此实现了高灵敏度。

图1所示。Synergy Neo中用于同时检测(A) TR-FRET或(B)发光分析的供体和受体荧光的双过滤器立方体示意图。

协同™H1

Synergy H1设计用于使用单个滤片和PMT提供高灵敏度。因此，在TR-FRET检测中加入了给体和受体荧光的顺序检测(图2A)，而发光信号检测如前所述。与Synergy Neo设计类似，光路(图2B)没有限制光传输的组件，如光纤电缆，因此实现了高灵敏度。

图2。(A)用于连续检测供体和受体荧光的Synergy H1过滤器立方体爆炸示意图。(B) Synergy H1滤波器立方体。滤光片和二色镜从2号位置移除，用于发光检测。

应用程序概述

以下生化或基于细胞的筛选应用分析了小分子对各种当前流行的药物发现靶点的影响。76化合物Screen-Well®核受体配体库(Cat。不。BML-2802)， 502复合筛孔天然产物文库(Cat。不。或43复合Screen-Well表观遗传学文库(Cat。不。由Enzo生命科学公司(Farmingdale, NY)捐赠的bl -2836)用于每个应用程序。检测化学成分包括HTRF®(Cisbio Bioassays, Codolet，法国)或发光检测技术。每个筛管都使用前面提到的液体处理仪器进行自动化处理。 Quantification of the emitted signals was accomplished using the appropriate Synergy microplate reader.

核受体

核受体构成了一个信号介导的细胞内受体的超级家族，在包括昆虫和脊椎动物(如人类)在内的多种物种中都有发现。作为转录调控因子，它们作为代谢配体激活的转录因子，调节许多功能，包括内稳态、发育和代谢，也在癌症和糖尿病等疾病中发挥作用。此外，它们被证明可以结合经药物设计修饰的小分子^3.．这种结合使得核受体成为流行的药理靶点。在美国批准销售的药物中，大约13%是核受体，其中有15种药物排在前200名处方药之列。2009年，这些顶级药物的销售收入达到275亿美元⁴．

雄激素受体激动剂/拮抗剂研究使用细胞为基础的核受体测定

INDIGO生物科学公司(State College, PA)的核受体检测系统利用专利的非人类哺乳动物细胞工程，提供全长、未修饰的核受体的组成性、高水平表达。INDIGO的报告细胞包括荧光素酶报告基因，其功能与一个真正的核受体响应启动子相连接。来自INDIGO的报告细胞的读数需要所有细胞内分子相互作用和事件的相同编排，可以预期在体内发生。因此，量化经处理的报告细胞中荧光素酶表达的变化，为核受体活性的变化提供了一种敏感的替代测量方法。

试验应用的原则是筛选测试样品，以量化功能活性，无论是激动剂或拮抗剂，他们可能发挥对核受体。在本文描述的项目中，荧光素酶基因的表达发生在配体结合雄激素受体(AR)经历核易位、DNA结合、招募和组装形成功能转录复合体所需的辅激活子和辅助因子之后，最终达到目标基因的表达。

Z的因素⁵进行了测试以验证自动384孔AR试验(图3A)。6α-氟睾酮(6α-FIT)作为对照化合物。以10 μM或0 μM化合物分别24个重复作为阳性对照和阴性对照。使用对照激动剂6α-FIT和对照拮抗剂Bicalutamide (BIC)也创建了剂量响应曲线，以验证自动分析生成正确化合物药理学的能力(图3B)。

图3。A. Z '因子验证数据。Z因子的值>0.5表示检测结果良好⁵．b电子商务₅₀6α-FIT为71 pM, IC为71 pM₅₀BIC的96 nM值与之前用手工方法生成的值相等。

76个成员筛孔核受体配体库，包含已知的核受体生物活性化合物，用于验证自动384孔人类雄激素受体测定设置，用于激动剂和拮抗剂筛选(图4)。

图4。人雄激素受体试验验证筛。在三种中间浓度下制备测试化合物，然后在以下浓度下筛选(n=6):•10 μM、•2.0 μM和•0.4 μM，以获得(A)激动剂活性或(B)拮抗活性。0.1% DMSO被纳入车辆控制。在拮抗剂试验中，用200 pM (~EC75) 6α-氟睾酮作为激发剂预处理细胞。折叠激活定义为[RLUTest Cmpd / RLU]_车辆控制］．折叠抑制被定义为[RLU_车辆控制/ RLU_{测试化合物}］．

将库化合物的发光信号与仅含0.1% DMSO的对照井的发光信号进行比较，得出折叠激活和折叠抑制值。命中定义为三种测试浓度中的两种的折叠值≥3的化合物。已知的AR激动剂和拮抗剂的结果，如6α -氟睾酮和米非司酮，证明了自动384孔人类雄激素受体测定法在准确检测AR调节剂方面的效用。

然后使用自动384孔人类雄激素受体测定法对506化合物筛选孔天然产物库进行筛选(图5)。

图5。筛井天然产物库(A)激动剂阳性和(B)拮抗剂阳性化合物摘要。在三种中间浓度下制备测试化合物，然后在以下浓度下筛选(n=1):•1:1000，•1:5000，•1:25000。0.1% DMSO被纳入车辆控制。根据拮抗剂试验，细胞被200 pM (~EC)预处理₇₅6α-氟睾酮作为挑战激动剂。

在去除假激动剂和拮抗剂(数据未显示)的测试之后，使用确认阳性的AR激动剂和拮抗剂生成完整的剂量-反应曲线，以确定EC₅₀或集成电路₅₀值(图6)。

图6。筛选阱核受体配体和天然产物库中的(A, B)激动剂和(C, D)拮抗剂复合剂量反应阳性试验。除6α-氟睾酮(B组，33.3 nM)和索拉索定(4.8 μM)外，激动剂和拮抗剂测定分别从10 μM和1:1000稀释液开始。电子商务₅₀或集成电路₅₀报告每个剂量响应曲线的值。

GPCRs

g蛋白偶联受体(GPCRs)是一种具有七跨膜α螺旋结构的膜蛋白。它们是最大和最多样化的蛋白质家族之一，其主要功能是将细胞外的刺激转化为细胞内的信号6。GPCRs参与许多生理过程，如行为和情绪调节、免疫反应、自主神经系统传输和肿瘤生长和转移。异常的信号转导与各种严重的疾病有关，如过敏、心脏病、癌症、高血压和炎症。因此，它们是最受欢迎的药物靶点之一，约占所有已批准药物的三分之一8。预计该市场将持续增长，到2018年将达到约1220亿美元⁹．

基于细胞的HTRF Tag-lite®分析GLP-1配体结合

Cisbio Bioassays的胰高血糖素GLP-1受体配体结合试验使用转染pSNAP-GLP-1质粒(PSNAPGLP1)的HEK293细胞24小时，然后用小融合标记snsnptbc标记(图7)。然后将标记的细胞冷冻在液氮和10% DMSO中。在本文描述的应用中，将细胞与待测化合物和Exendin 4-red (L0030RED) (Exendin 4的荧光衍生物)一起依次添加到检测板中。当荧光配体与GLP-1受体结合时，与GPCR结合的Lumi4 Tb供体与发出红色标记的配体之间发生了时间分辨的荧光共振能量转移。非标记化合物和Exendin 4-red (4 nM)之间的竞争减少了能量转移，从而导致htf信号的降低。

图7．由htf供体荧光团标记的GPCR组成的标记lite系统。将带有SNAP-tag的GPCR克隆到细胞系中，用供体荧光团对其进行特异性标记。

筛孔天然产物库1-4板中的384个化合物被重复筛选。化合物从原始的100% DMSO库存中预稀释1:250，然后以最终的1:1000稀释进行筛选。无化合物(0%抑制)对照包括Exendin-4，未标记的GLP-1受体激动剂，以及已知的拮抗剂GLP-1(9-36)和Exendin-3(9-39)。当绘制复合抑制率数据时，观察到一个类似于在较大的复合库主屏幕中看到的分布剖面(图8)。

图8．天然产物复合库筛分抑制分布。

大多数化合物表现出很少或没有抑制作用，而一小部分化合物表现出较高的正或负抑制作用。供体分子荧光信号评估可用于确保化合物表现出真正阳性或阴性的红色标记激动剂结合抑制(图9)。这种控制，在htf技术中固有，提供了一种快速去除错误击打的方法。一个错误结果的例子是Chelerythrine。

图9。代表性GLP-1受体和试验抑制数据。红色标记的Exendin-4激动剂的抑制率和0%抑制孔中供体分子荧光值的百分比显示为天然产物库化合物1-24。

该化合物表现出较高的负抑制作用，但也使供体分子信号降低约50%。相比之下，Exendin-3、Exendin-4和GLP-1均表现出较高的正向抑制作用，对供体分子的荧光信号无负向影响。

在主化合物库屏幕上，对红色激动剂结合抑制呈阳性且对供体分子荧光信号无影响的化合物生成了剂量响应曲线(图10)。从浓度为10 μM的化合物开始，建立了8点1:10滴定曲线。Ki数据由IC计算₅₀结果使用Cheng-Prusoff方程¹⁰(表1)。

图10。阳性抑制剂化合物产生的剂量响应曲线。

表1．K_我阳性抑制剂化合物的值。

激酶

细胞激酶通过磷酸化将磷酸基从供体(如ATP)转移到特定的底物上。因此，它们在通过信号转导将信号从位于细胞膜上的激活受体传递到细胞内部的过程中发挥着重要作用。与它们相关的细胞过程包括血管生成、细胞生长、细胞迁移和凋亡。激酶的过度表达，或构成活性，也与许多疾病状态有关，包括血管疾病，骨骼疾病和多种形式的癌症。因此，细胞激酶仍然是药物开发的重要靶点。2011年激酶抑制剂的全球收入接近291亿美元，预计2015年将达到近403亿美元¹³．

使用基于细胞的HTRF®蛋白激酶测定法定量内源性细胞激酶活性

Cisbio Bioassays的HTRF细胞激酶分析方法旨在直接检测和研究整个细胞中激活的激酶。受体激活后，激酶被激活，导致激酶磷酸化。在细胞膜裂解后，加入两种单克隆抗体即可检测到磷酸化的激酶:一种是用d2标记的抗总抗体，另一种是用Eu3+-cryptate标记的抗磷酸化激酶抗体。该方法基于夹心免疫分析法原理。在磷酸化激酶的存在下，随着Eu3+-隐蛋白的激发，能量被转移到d2分子，在665 nm处可见发射。在没有磷酸化激酶的情况下，没有能量转移，也没有检测到665 nm信号(图11)。

图11．HTRF细胞激酶检测原理。受体激活后，激酶被激活，导致激酶磷酸化。细胞膜裂解后，加入两种单克隆抗体即可检测到磷酸化的激酶:一种带有d2标记的抗总抗体和一种带有Eu标记的抗磷酸化激酶抗体^{3 +}穴状化合物。

在本文描述的工作中，利用人类上皮癌细胞系A431, phospho-STAT3 (Tyr705)试验被用于评估导致Tyr705位点STAT3激酶磷酸化的EGFR信号通路的潜在抑制剂。正如欧委会所证明的那样，初步测试表明，自动化检测程序是准确和可靠的₅₀EGF刺激值为61.5 nM(相比之下，检测制造商先前产生的180 nM)， Z ' -因子评分为0.79(图12)。

图12。(A) EGF对STAT3(Tyr705)磷酸化的刺激表现为全剂量反应;(B)在600 nM和载体的[EGF]下，40次重复测量得到的Z′因子评分。

然后使用筛井天然产物库进行抑制剂筛选。化合物再次从100% DMSO库存中预稀释到三种中间浓度，然后以最终浓度20、4和0.8 μg/mL进行筛选。所有井均注入200 nM的EGF (1X)。无化合物(0%抑制)对照包括三种已知的STAT3激活抑制剂:SD 1008，静态和隐丹参酮。当绘制每种筛选浓度的复合抑制率数据时，可以观察到以下分布曲线(图13)。

图13。筛选浓度为(A) 0.8 μg/mL， (B) 4.0 μg/mL， (C) 20 μg/mL时天然产物库化合物的抑制率分布。

图14。平板5和6%抑制和%阴性对照620信号结果来自于使用screen - well天然产物库的phospho-STAT3 (Tyr705)分析筛选。

很明显，许多化合物在较高浓度下对620信号有影响，这可能导致错误的抑制数据。进一步的测试是必要的，以确定潜在的库抑制化合物可能对A431细胞的任何细胞毒性作用，并确定每个化合物的完全抑制特性。

对筛剂中包括的三种对照化合物进行了初步剂量反应研究。从100 μM的1倍浓度开始，使用1:2稀释方案进行11点滴定(图15)。集成电路₅₀从每个抑制曲线计算值(表2)。

图15。使用小分子抑制剂SD 1008、静丹酮和隐丹参酮抑制egf诱导的STAT3(Tyr705)磷酸化。

表2．集成电路₅₀已知STAT3激活抑制剂的值。

表观遗传学

每个细胞中的DNA分子被组蛋白包裹，统称为染色质。这有助于压缩DNA链，并控制基因表达。染色质结构的改变是由表观遗传因素的添加或删除控制的，如甲基或乙酰基，组蛋白的尾巴。松弛的染色质结构允许基因转录，而相反的染色质结构使这部分遗传密码沉默。这是细胞分化的正常过程。然而，失去适当的表观遗传控制会导致基因表达异常和多种疾病的发展，包括糖尿病、癌症或神经障碍。这导致了许多新的研究，并使表观遗传学成为增长最快的药物发现市场之一，预计到2015年，全球市场将达到182亿美元¹⁷．

用生物荧光组蛋白去乙酰化酶I/II试验评估HDAC1的抑制作用

来自Promega公司(Madison, WI)的HDAC- glo™I/II测定法是一种单试剂添加、均相、发光测定法，可测量来自细胞、提取物或纯化酶源的组蛋白去乙酰化酶(HDAC) I类和II类酶的相对活性。该方法广泛适用于I类和II类酶，并使用乙酰化的活细胞内发光肽底物，该底物可被HDAC活性去乙酰化(图16)。使用偶联酶系统测量肽底物的去乙酰化，其中显影试剂中的蛋白酶从氨基荧光素中裂解肽，在使用Ultra-Glo™重组荧光素酶的反应中进行量化。hdac介导的发光信号与脱乙酰酶活性成正比。

图16。HDAC-Glo I/II检测原理。所有三种酶对底物的修饰在加入一种试剂时发生耦合的，几乎同时发生的反应。

在这里，我们使用HDAC-Glo I/II试验以低体积384孔格式筛选HDAC1抑制剂。最初的实验，使用预先确定的酶浓度为10 ng/mL(数据未显示)，验证了自动化分析程序提供了准确和可靠的结果(图17)。的集成电路₅₀Trichostatin A的值为1.04 nM与先前发表的数据18一致，Z ' -factor评分为0.87证实了其筛查的适用性。

图17．(A) Trichostatin A抑制HDAC1酶活性的剂量响应曲线;(B) 24次重复测量的Z '因子评分，每次在500 nM和载药时[Trichostatin A]。

然后使用screen - well表观遗传学文库进行复合筛选。另外5种化合物也被包括在内，它们被证明可以抑制各种表观遗传蛋白质的活性。化合物从10 mM, 100% DMSO原液中稀释到三种中间浓度，然后以最终浓度20,2和0.2 μM筛选。抑制率(图18)通过比较每种化合物浓度与无化合物、无抑制酶反应对照的发光值来计算。

图18。%抑制结果来自使用screen - well表观遗传学库的HDAC1检测筛选。

在三种测试浓度中，对酶活性的抑制均大于50%的化合物，包括已知的HDAC抑制剂和SIRT激活剂白藜芦醇、piceeatol和氨基白藜芦醇硫酸盐，被用于剂量反应测试。完成了两项不同的测试。每次试验采用1:4稀释方案，从100 μM的1倍浓度开始进行12点滴定。首先确定了每个先导化合物的特定抑制特性(图19A)。集成电路₅₀从每个抑制曲线计算值。第二个测试确定了每种化合物对检测步骤中使用的成分的抑制电位(图19B)。在检测试剂中加入非乙酰化HDAC-Glo I/II对照底物。对照底物不需要去乙酰化来产生发光，因此不受HDAC抑制剂的影响。

图19所示。使用(A)标准检测试剂组分或(B)检测试剂加对照底物生成的“命中”化合物的剂量响应曲线。

剂量反应试验证实，每个已知的HDAC抑制剂都表现出真正的HDAC1活性抑制，因为当每个化合物与对照底物测试时，没有看到发光信号的显著负变化。这与三种SIRT激活剂化合物形成对比，它们显示出在高化合物浓度下对检测试剂组分有负面影响的证据。因此，这些化合物不应与其他化合物一起作为HDAC1活性的实际抑制剂。

结论

虽然高通量筛选市场继续感到巨大的压力，导致方法和思维方式的一些变化，可用于HTS的工具也继续适应和发展。新的化学实验，包括生物化学和细胞化学，使用越来越像活体的模型给出了更精确的答案。BioTek的液体处理和检测仪器也满足了行业的新需求。Precision™，EL406™和MultiFlo™可用于自动化许多检测过程，包括复杂的任务，如培养基交换和缓冲液清洗的细胞为基础的检测。然后可以结合合适的Synergy™多模式Microplate Reader来检测来自特定检测的发射信号。总之，分析化学和仪器仪表的结合创造了一个理想的解决方案，以满足当今高通量筛选实验室的需求。

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